DGCR2靶向亲合体分子用于β细胞药物递送及成像试剂开发

1型和2型糖尿病的共同特征是胰腺中分泌胰岛素的β细胞数量逐渐减少。针对β细胞进行直接且特异性靶向的新方法，可为药物试剂的递送提供平台。正电子发射断层扫描（PET）等成像技术依赖于成像试剂高效、特异性的递送，可加深人们对糖尿病病因的理解，并为胰腺及胰岛移植物中活体β细胞质量提供生物标志物。此前，DiGeorge综合征关键区域基因2（DGCR2）蛋白为胰腺中一种特异性β细胞蛋白，但迄今为止尚缺乏适用于靶向药物递送或分子成像的高亲和力结合剂。亲合体（Afffbody）分子是一类具有优异分子成像性能的小分子亲和蛋白。Cheung等^[1]人进一步证实了DGCR2在胰腺及干细胞（SC）来源的β细胞中的存在，并描述了多种靶向人类DGCR2的Afffbody分子候选物的构建与筛选过程。该研究通过自主研发的定向进化方法，制备并评估了新的DGCR2结合Afffbody分子的热稳定性与亲和力。随后将这些Afffbody分子变体进一步开发为靶向递送成像试剂至β细胞的载体。Afffbody分子ZDGCR2:AM106表现出纳摩尔级亲和力、良好的稳定性及生物分布特性，对胰岛细胞毒性极低，可作为进一步开发用于药物和成像试剂特异性递送至β细胞的候选先导化合物，同时也为许多疾病的诊断及治疗靶向药物开发提供了新的思路。

Afffbody靶向递送原理：

图1 利用DGCR2靶向递送药物和成像试剂至β细胞的概念 Afffbody结构特征：.png

图1 利用DGCR2靶向递送药物和成像试剂至β细胞的概念

1.Afffbody结构特征：

Afffbody分子是一类分子量约为7 kDa（58个氨基酸）的小型支架蛋白。Afffbody分子由三个α-螺旋组成，其中第1和第2个螺旋经过设计，通过包含13至15个可变氨基酸残基来提供结合表面，而其余序列以及第3个螺旋则保持恒定。Afffbody分子在临床前和临床研究中已被广泛用于分子成像的示踪剂，其成像对比度表现良好，这主要归因于它们较小的尺寸以及普遍较高的亲和力和特异性。由于体积小，这些分子可通过肾脏快速清除，从而具有良好的药代动力学特性，并为分子成像提供优异的对比效果。此外，Afffbody分子能迅速从血液中渗出并高效穿透组织，这一特性有利于靶向病变组织。

图2 Afffbody结构图.png

图2 Afffbody结构图

2.Affibody分子的亲和力成熟：

为了获得对DGCR2具有更高结合能力的Affibody分子，该研究设计了一个亲和力成熟文库，通过随机化螺旋1和螺旋2的结合表面的13个位置。该DNA文库被克隆至大肠杆菌展示载体中，通过电穿孔将质粒文库导入细胞后，获得转化株。经验证后，该文库在大肠杆菌表面表达，并进行了四轮FACS分选和分析，期间每轮交替进行细胞生长扩增。流式细胞仪对库中靶标结合特性的可视化显示，在每轮分选中DGCR2阳性克隆均得到富集（图3）。

图3 大肠杆菌展示Affibody成熟文库在四个连续FACS轮次中的结果图.png

图3 大肠杆菌展示Affibody成熟文库在四个连续FACS轮次中的结果图

3.Affibody分子热稳定性表征：

为进一步表征而筛选出的新变体（ZDGCR2:AM106、ZDGCR2:AM115和ZDGCR2:AM156）以及原始的Affibody分子ZDGCR2:3D1，均进行了定点突变，并引入了支架位点突变S42A、E43N、S46A和S54A。热诱导变性前后对圆二色光谱（CD）光谱进行检测，结果表明其中三种变体（ZDGCR2:3D1、ZDGCR2:AM106和ZDGCR2:AM156）完全恢复了折叠状态，且具有良好的热稳定性。所有评估的Affibody分子在约60°C温度下均表现出良好的稳定性（图4）。

图4 Affibody在20至100°C范围内通过变温测量评估热稳定性.png

图4 Affibody在20至100°C范围内通过变温测量评估热稳定性

4.Affibody分子的亲和力表征（基于SPR）

通过SPR基于生物传感器的检测，分析了Affibody分子（ZDGCR2:3D1、ZDGCR2:AM106、ZDGCR2:AM115和ZDGCR2:AM156）与DGCR2之间的相互作用。结果表明，三种亲和力成熟变体相较于原始变体ZDGCR2:3D1，对DGCR2的亲和力显著增强（图5）。

图5 Affibody分子SPR亲和力检测结果.png

图5 Affibody分子SPR亲和力检测结果

5.铟-111标记的DOTA偶联Affibody分子的功能与生物分布

通过SPECT技术，评估了铟-111标记的Affibody分子在大鼠体内的心脏、肝脏、肾脏、脾脏及肺部的生物分布、背景组织摄取及清除情况。所有Affibody分子均以肾脏清除为主（图6A）。通过动态PET/CT在大鼠体内检测了[68Ga]ZDGCR2:AM106的动态生物分布，并结合伽马计数器对离体器官进行测量以进一步验证。结果显示，[68Ga]ZDGCR2:AM106主要经肾脏清除（图6B-D）。

图6 铟-111标记的DOTA偶联Affibody分子的功能与生物分布验证结果.png

图6 铟-111标记的DOTA偶联Affibody分子的功能与生物分布验证结果

7.体外Affibody暴露对人分离原代胰岛的影响

鉴于DGCR2在人类β细胞中的功能尚不明确，评估其暴露于ZDGCR2:AM106后对胰岛功能、胰岛素分泌或细胞存活性产生的不良影响具有重要意义。胰岛灌注实验（n=3）显示，在高葡萄糖刺激下，无论是否暴露于高剂量的ZDGCR2:AM106，胰岛素释放均呈现出典型的双相模式（图7A）。因此，暴露于ZDGCR2:AM106的人类胰岛并未抑制或增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，这可能会影响旨在调节胰岛素分泌的药物，或导致低血糖等不良副作用。此外，将人胰岛以最高达60 μM的浓度与ZDGCR2:AM106孵育，未观察到对胰岛数量或存活性有明显可见的影响（图7B）。

图7 体外Affibody暴露对人分离原代胰岛的影响验证.png

图7 体外Affibody暴露对人分离原代胰岛的影响验证

8.小结：

该研究基于Affibody分子支架技术，成功合成了并表征了多种高亲和力的β细胞特异性蛋白DGCR2结合物。其中，ZDGCR2:AM106表现出优异的亲和力、稳定性与重折叠能力，以及适宜的生物分布和安全性特征，显示出作为进一步开发DGCR2靶向药物递送或成像试剂候选物的潜力。

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参考文献：

[1] Cheung, P., Persson, J., Zhang, B. et al. DGCR2 targeting affibody molecules for delivery of drugs and imaging reagents to human beta cells. Sci Rep 15, 417 (2025).