语言

中文

下拉箭头
泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家
菜单
泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家
首页 / 技术支持 / 检测服务专题

蛋白纯化完了干什么？这四种验证方法你必须知道！


回顾前文我们讲解了重组蛋白原核表达系统，以及常用到的蛋白表达标签。那么问题来了，蛋白纯化成功后，这些珍贵的蛋白能用来做什么呢？

1. WB

首先这是第一步，也是最容易忽略的一步。它可以帮你确定所纯化的是否是目的蛋白，别白忙活。简单来说就是通过凝胶电泳分离蛋白质，再将蛋白电转至膜上，利用抗体与目标蛋白的特异性结合进行显色检测，验证是否是目的蛋白。

步骤：制样（上样缓冲液煮样）→电泳（SDS PAGE分离蛋白）→转膜（PVDF膜/NC膜）→封闭（5% BSA或脱脂牛奶室温封闭1小时或4℃过夜）→孵一抗（4℃过夜孵育更省抗体）→孵二抗→显影（避光）

image.png

表1 WB注意事项

 

1. CO-IP

想要确定两个蛋白在体内是否发生互作，CO-IP是你的首选。说白了，就是利用抗原抗体的特异性结合，固定于磁珠上的抗体能够拉出目标抗原以及互作蛋白。

步骤：预清（裂解液+磁珠除去非特异性结合）→孵育IP级一抗（裂解液中加一抗4℃过夜）→抓复合物（磁珠与一抗Fc区域结合）→洗脱（抗体A+蛋白X+蛋白Y）→WB验证（CO-IP的产物必须通过WB才能证明互作蛋白的存在）


image.png

表2 CO-IP注意事项

 

1. 染色质免疫共沉淀（ChIP）

ChIP和CO-IP原理类似，区别是研究对象是DNA和蛋白。是通过甲醛交联固定细胞内与DNA结合的蛋白，超声打断DNA后，用抗体富集目标蛋白及其结合的DNA片段。

步骤:交联（甲醛固定）→超声破碎（将DNA打碎200-1000 bp片段）→免疫沉淀（加入抗体和磁珠）→解交联（65℃加热，释放DNA）→DNA纯化→PCR分析


image.png

表3 ChIP注意事项

 

1. Pull down

如果同时拥有蛋白A和蛋白B，想知道它们能不能直接互作，而不需要第三者，就选PuII down。一句话来说，就是将携带标签的蛋白A（如GST，His）固定于亲和磁珠上，随后与蛋白B或者细胞裂解液孵育，直接得知是否互作。

步骤（以GST为例）：纯化蛋白（GST标签和含GST蛋白）→与谷胱甘肽磁珠孵育→与细胞裂解液（含猎物蛋白）孵育→洗脱→WB验证


image.png

表4 Pull down注意事项

 

可靠的实验结果从来不是靠一种技术得到的，这张表可以帮助你快速做出决策，在实际应用中通常是选择几种进行验证，比如CO-IP实验确定的互作蛋白，还需要WB来验证。


image.png


泰克生物科技（天津）有限公司建立了完善的蛋白表达纯化平台，致力于为全球科学家提供高质量的蛋白表达与纯化开发服务，包括表达系统选择（大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞）、载体构建与设计、表达条件优化、下游纯化以及质量验证等一站式服务。我们顺应生命科学发展的需求，为客户开发创新性的生物学工具和治疗用蛋白，为客户的科研项目提供有力支持。

 

上一篇:酵母双杂交技术揭示小麦抗病新机制：TaPIRI如何“劫持”TaHRPI抑制叶绿体功能？ 下一篇:蛋白总是不表达？可能是你的标签没选对！
相关推荐

体验泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家的可靠服务，请订阅：

底部背景

联系方式

  • 电话：400-168-8285
  • 邮箱：info@tekbiotech.com
  • 地址：天津市武清区国际企业社区A5号楼
知乎 新浪微博 百度 哔哩哔哩
微信公众号

微信公众号

技术支持

技术支持

©2026泰克生物科技（天津）有限公司津ICP备2021009144号-1津公网安备12011402001524号