噬菌体展示-噬菌体展示技术专题-泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家

噬菌体展示

针对癌细胞得治疗最关键是找到能够特异性识别癌细胞表面标记的蛋白，也就是抗体。但是传统抗体制备技术时间长，且很难对任意靶点进行定制。1985年Smith发现了一种新的技术—噬菌体展示技术，它能够帮助我们从海量候选分子中快速、高效的筛选出高亲和力、高特异性分子。

原理

M13丝状噬菌体表达主要衣壳蛋白pVIII和次要衣壳蛋白pIII，以及其他次要衣壳蛋白 pVI，pVII，pIX，但是这些拷贝数极低适合单价或者低拷贝数展示，有时也可用于特殊展示和pVIII或pIII联用，即一个病毒颗粒上展示两种不同的分子。

phagepro tech?的核心原理即外来肽段或者蛋白的基因与某个衣壳蛋白基因融合，随着噬菌体的组装外源分子展示在噬菌体表面，而与之对应的基因在噬菌体内，这样便可以将表型与基因型精准链接，为下游改造提供基础。

pVIII蛋白：分子较小，虽然是高拷贝，但是pVIII是噬菌体组装的关键蛋白，因此N端容纳的肽段大小非常有限，适用于展示短肽表位，多用于表位定位、抗原模拟或筛选具有特定功能的短肽。

pIII蛋白：低拷贝，分子较大，pIII的C端对感染至关重要，因此改造时应保留C端。其N端能容纳较大的蛋白三种结构域，比如抗体片段scFV、Fab等，通常用于高亲和力配体。

图1 M13丝状噬菌体pVIII展示OVA分子^【1】

文库构建技术流程

以scFV文库构建为例。

1. 获得cDNA。首先分离B细胞，利用试剂盒或者TRIzol/酚氯法提取总mRNA，反转录为总cDNA。

2. 体外合成VH和VL基因。利用简并引物（一套混合的引物，其序列在某些位置上是多种碱基的混合物）体外扩增出所有B细胞可变区。因为抗体可变区的两端序列相对保守，中间部分具有高度可变性，所以简并引物能够扩增出不同家族的VH和VL基因，确保库的多样性。

3. 体外连接形成scFV分子。设计柔性肽连接子，将VH、连接子、VL三者通过重叠序列拼接，VH和VL可能来自于不同的B细胞，将它们随机组装成完整的scFv基因。

4. 体外构建完整噬菌粒。将一定比例的多样化scFv基因片段混合物与线性化载体、连接酶在试管中混合。单个scFv基因片段会随机地与单个载体分子连接，形成完整噬菌粒（缺乏元件不能自主组装）。

5. 电转大肠杆菌。重组噬菌粒电转化大肠杆菌，理论上每个大肠杆菌只存在一种噬菌体，因为M13噬菌体pIII蛋白的C端识别并结合到性菌毛的顶端，随后，菌毛立即解聚^【2】。但是菌毛解聚现象是暂时，因此要控制好重组噬菌粒感染滴度。

6. 文库的扩增。收集培养上一步中的细菌菌落，使用辅助噬菌体感染混合菌落。辅助噬菌体含有完整噬菌体扩增的必需元件，这样重组噬菌粒便可在大肠杆菌中进行复制和组装，且每一种细菌只产生一种展示外源基因的噬菌体，收集空斑即可得到多样化的scFV噬菌体文库，加入甘油保存在-80℃。

得到噬菌体文库就可以进行下一步文库筛选了。

泰克生物科技（天津）有限公司基于噬菌体展示技术，建立了完善的靶向抗体药物发现平台，能够为全球的科学家提供高质量VHH中和单克隆抗体开发服务，包括但不限于基于GPCR靶点、肿瘤靶点、各类疾病靶点等的药物单抗的前期开发与验证服务，提供从项目方案设计到成药性评估等一站式技术服务，满足各类客户对于药物单抗开发的需求。

参考文献

1. Hess KL, Jewell CM. Phage display as a tool for vaccine and immunotherapy development. Bioeng Transl Med. 2019 Sep 18;5(1):e10142.

2. Schmitz U, Versmold A, Kaufmann P, Frank HG. Phage display: a molecular tool for the generation of antibodies--a review. Placenta. 2000;21 Suppl A:S106-S112.