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酵母杂交文库构建：Smart技术
酵母杂交文库为cDNA文库，cDNA代表特定组织或细胞在特定时间正在表达的基因信息，用于筛选伴侣蛋白。获取cDNA的常规方法有逆转录法，但是这种方法有一个弊端，逆转录酶可能由于mRNA的二级结构、降解或者酶本身导致不能达到mRNA的 5'末端，合成的cDNA第一条链不完整缺失了mRNA的5'末端的信息。而Smart技术很好解决这一问题，该技术有一个关键点是只有当逆转录酶真正成功到达mRNA的 5'末端时（包括帽子结构），才能被筛选到，完整的cDNA才能有效合成。
真核生物mRNA含有两个特殊结构即5'端帽子（5'Cap），m7GPPPN和3'端由多个腺苷酸组成的poly（A）尾。根据这一特性RNA逆转录时一般使用富含脱氧胸苷酸的通用引物Oligo（dT），以mRNA为模板向引物3'端延伸，当逆转录酶完全到达mRNA的5'末端时，cDNA会由于和帽子结构互补出现几个脱氧胞苷酸（dC），这是一个成功的标志。这时预先加入反应体系中的Smart 引物，其3'端带有3个核糖鸟苷酸（rG），会与cDNA中的脱氧胞苷酸特异性结合。逆转录酶会进行模板转换【1】，以Smart 引物为新的模板继续合成cDNA。第一条完整的cDNA单链其5'末端是dT，3'末端是Smart 引物的互补序列，中间则是mRNA的互补序列。最后以完整的cDNA为模板，设计一条PCR正向引物，即与Smart 引物序列完全相同；设计一条反向引物与Oligo（dT）序列相同，从两边同时开始进行长距离PCR扩增。因只有当逆转录酶完整到达mRNA的5'末端时，cDNA序列完整才能和Smart 引物互补，所以得到的是全长cDNA，将全长cDNA与转录激活因子的AD结构域融合，即可形成“猎物”文库。
图1 Smart技术建库工作原理
Smart最突出的优点能够优先富集含有完整5'末端的cDNA分子，高效获取全长cDNA，提高cDNA文库的全长比例；其次因后续有PCR扩增过程，所以起始模板RNA的含量需求极低，通过Oligo（dT）引物可直接使用总RNA为模板，省去单独分离poly（A）+mRNA的过程，操作简单快速、流程一体化。
但是Smart技术仍然具有一定的局限性，只适用于含有poly（A）的真核生物mRNA，其他RNA如果想要采用该方法，则需要改用随机引物法进行修饰，操作成本和保真度将极大不同；其次由于某些RNA的5'末端会形成复杂的二级结构，可能难以被完全转录；PCR扩增并非完全均一性，长片段cDNA、GC含量高的cDNA扩增效率可能较低。
总之，Smart技术通过酶转换机制，解决了微量RNA模板和合成全长cDNA的问题，尽管具有一定的局限性，但是该技术在前沿单细胞研究中仍然是不可缺少的。当进行第三代测序需要获取全长转录基因信息时，Smart技术是最好的选择。
泰克生物科技（天津）有限公司建立了完善的酵母杂交技术平台，致力于为全球科学家提供高质量的蛋白相互作用分析服务，包括实验方案设计、文库筛选、诱饵载体构建、酵母双杂交/单杂交体系优化以及下游的相互作用验证和数据分析（包括免疫共沉淀、荧光素酶报告基因检测等）等一站式服务， 为客户的科研项目提供有力支持。
参考文献
[1]Vardi O,Shamir I,Javasky E, et al. Biases in the SMART-DNA library preparation method associated with genomic poly dA/dT sequences. PLoS One. 2017;12 (2):e0172769.
津公网安备12011402001524号