酵母杂交文库构建：Gateway技术-酵母展示技术专题-泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家

酵母杂交文库构建：Gateway技术

背景

酵母文库就像储存大量外源片段的容器，该文库将酵母细胞作为载体，把表达外源蛋白的基因插入到酵母细胞内，形成一个大集合，酵母文库可以用来研究基因的功能和互作等多方面，是研究生命过程中不可缺少的技术。

通过酵母文库可以研究体内生命调控网络，发现新的蛋白通路，推进实验进展，酵母杂交技术是研究分子与蛋白，蛋白与蛋白之间互作的经典技术，被广泛认可。

酵母作为一种真菌，其真核特性和便于工业生产的特点，被广泛应用于生命科学的研究，酵母文库的构建方法主要运用Gateway和SMART法两种，这两种技术应用于不同的需求和条件，本文主要介绍Gateway方法。

原理

Gateway 法是依据噬菌体λ（int）编码的位点特异性重组酶，可以将宿主基因与病毒基因整合重组，并将其从宿主染色体中分离出来的特性开发的。Int 执行一种高度定向、严格调控的反应，并依赖于辅助 DNA 弯曲蛋白（IHF）。这种机密的调控使整合型和切除型重组两种途径得以实现，不同的生理和环境信号决定了，这两种途径相反且实际上方向不可逆^【1】。具体如图所示：聚合酶λ-int在辅助整合因子IHF的帮助下，将超螺旋位点attP与线性位点attB进行基因整合重组，从而产生一个包含有attR和attL位点的整合噬菌体染色体，聚合酶λ-int在Xis(噬菌体编码的切除酶)、IHF以及Fis蛋白的作用下，切除重组再生attP和attB。

图1 噬菌体与宿主基因组整合分离工作模式图

基于这种方法，位于重组位点两侧的 DNA 片段（例如基因）可以在体外与另一种也含有重组位点的新载体混合，并与噬菌体整合酶重组蛋白一起孵育，以将基因转移到新的载体中。Gateway法包含两大部分一个是入门克隆的构建，一个是将入门克隆整合到表达载体内（图2 B）。

入门克隆（图2C）：通过PCR在基因片段加入重组位点attB1和attB2，将其与含有位点attP1和attP2的供体载体孵育，在体系中加入λ-int和辅助整合因子IHF，重组整合后载体上插入的基因两端出现新的重组位点attL1和attL2。

重组到表达载体（图2D）：将整合后带有attL1和attL2的质粒与含有attR1和attR2位点的表达载体（酵母表达载体）共孵育，在体系中加入纯化后的λ-int、Xis、IHF蛋白因子，促使基因片段整合到表达载体，重组反应只能在 B1和P1、B2和P2、L1和R1以及L2和R2 之间进行，以确保DNA方向正确。

这两个载体att位点P1-P2和R1-R2之间都含有ccdB基因（该基因的表达产物会干扰 DNA 螺旋酶），当质粒构建完整，基因组成功整合时ccdB将被替换而存活。最后将质粒电转入酵母细胞中保存。

图2 Gateway原理模式图^【2】

泰克生物科技（天津）有限公司基于噬菌体展示技术和酵母展示技术，建立了完善的靶向抗体药物发现平台，能够为全球的科学家提供高质量的包括scFv、VHH、Fab等各种类型药物单抗开发服务，并且能够开发各种功能性的结构特征抗体（包括但不限于中和抗体、构象特异性抗体、交叉反应抗体等），同时泰克生物也能够提供配套的下游抗体表达验证、抗体人源化设计与验证、抗体亲和力成熟、CAR-T候选序列设计等相关服务，满足各类客户对于药物抗体开发的需求。

参考文献

[1] Landy A. The λ Integrase Site-specific Recombination Pathway. Microbiol Spectr. 2015;3 (2):MDNA3-0051-2014.

[2] Walhout AJ,Temple GF,Brasch MA, et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 2000;328:575-92.

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