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酵母双杂交技术揭示小麦抗病新机制：TaPIRI如何“劫持”TaHRPI抑制叶绿体功能？
叶绿体是免疫和光合作用中的关键。但是在植物免疫中控制光合作用相关核基因（PhANGs）表达的调控机制仍然了解不够透彻。因此张等人通过酵母双杂交技术，发现了转录因子E3泛素连接酶（TaPIRI）通过降解转录因子TaHRPI，负调控小麦对条锈菌（Puccinia striiformis，Pst）的抗性。他们敲除TaHRP1发现小麦会降低对Pst的抗性，过表达TaHRP1有助于光合作用、ROS的产生，进而提高对疾病的抗性。总之，TaPIR1泛素化降解TaHRP1会影响了PhANGs的表达，进而降低植物对Pst的抗性。
1. CRISPR-Cas9构建突变体：TaPIR1是小麦负防御调控因子
首先对叶片进行处理，双敲除TaPIR1突变体（tapir1-AB），将优势菌株CYR31和CYR34分别接种野生型和突变型叶片（图1a），观察14天后发现野生型表面布满孢子；通过qRT-PCR验证（图1b)和野生型相比，突变体的Pst/小麦生物量比值差异极显著；通过显微观察Pst侵染叶片的结构，发现24小时后野生型Pst发育成熟（图1c），且菌丝长度和侵染面积与突变体差异极显著（图1d）；利用DAB染色法发现突变体周围出现大面积红褐色沉淀（图1e），H202积累量显著增加,同时定量发现差异极显著（图1f）；综上所述，敲除TaPIR1可增强ROS积累、抑制Pst侵染与繁殖，从而显著提升小麦抗病性。
图1 TaPIR1负调控小麦抗Pst
2. 蛋白互作验证：TaPIR1负调控TaHRP1
他们通过酵母双杂交技术（图2a），发现仅pBD-TaPIR1+pAD-TaHRP1以及阳性对照P53组合能在SD-LWHA上生长，且产生蓝色菌落，而空载体未生长说明两者特异性互；通过双荧光互补验证（图2b），仅TaPIR1：cYFP+TaHRP1：nYFP组合在细胞核内观察到黄色荧光；通过GST pull-down进行体外功能验证（图2c），TaPIR1与TaHRP1在体外无需其他蛋白介导可直接结合；通过免疫共沉淀验证（图2d)，在植物体内，两者结合真实存在；体外泛素化验证（图2e，f），TaPIR1是功能性E3泛素连接酶，特异性泛素化TaHRP1的K131和K136赖氨酸位点，且TaPIR1的表达水平与TaHRP1的泛素化呈正相关。
图2 TaPIR1与TaHRP1的相互作用及泛素化修饰
3. DAN-seq全局筛选靶基因：TaHRP1直接调控光和相关基因
该研究使用DAN-seq测序技术（图3a）筛选在小麦全基因组上TaHRP1的潜在靶点，发现基因组上的HBS序列是TaHRP1的结合位点；并使用KEGG数据库（图3b）发现TaHRP1的靶基因富集于光合作用通路，可能是通过调控这些基因来影响叶绿体的功能；他们进一步研究（图3c，d，e，f）发现TaHRP1的N端可特异性结合含有HBS基序的PhANGs的启动子区域,并且这种结合具有高亲和力。
图3 通过DAN-seq鉴定TaHRP1与PhANG特异性结合
4.整体机制工作模型
图4 Pst侵染小麦期间TaPIR1-TaHRP1级联作用的工作模型
这一结果闭环了调控链：TaHRP1通过激活PhANGs增强叶绿体功能，促进ROS产生以激活免疫；而TaPIR1通过降解TaHRP1，切断这一抗病通路。
该研究通过酵母双杂交技术，首次揭示了泛素化调控小麦条锈病抗性的新通路建立完整调控网络：泛素化修饰（TaPIR1）-转录调控（TaHRP1）-叶绿体功能（PhANGs）-ROS免疫信号。
泰克生物科技（天津）有限公司建立了完善的分子互作和酵母杂交体系，致力于向全世界科学家提供优质的酵母单杂交技术服务、酵母双杂交技术服务（包括核体系和膜体系酵母双杂交）、文库构建、文库筛选、点对点验证（包括自激活验证）等相关技术服务，为我们合作伙伴的科研课题提供有力的技术支持。
参考文献
[1] Zhang, R., Wu, Y., Qu, X. et al. The RING-finger ubiquitin E3 ligase TaPIR1 targets TaHRP1 for degradation to suppress chloroplast function. Nat Commun 15, 6905 (2024).
津公网安备12011402001524号