GPCR纳米抗体选择性和拮抗作用的结构基础-纳米抗体专题-泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家

GPCR纳米抗体选择性和拮抗作用的结构基础

G蛋白偶联受体（GPCR）是关键的治疗靶点，但其复杂的结构给有效的药物设计带来了挑战。纳米抗体或单域抗体已成为一种有前途的靶向GPCR的治疗策略，与传统的小分子和抗体相比具有优势。然而，对GPCR-纳米抗体相互作用的结构特征的不完全理解限制了它们的发展。Schlimgen等[1]人研究了一种靶向非典型趋化因子受体3（ACKR3）的纳米抗体拮抗剂VUN701，并确定ACKR3结合需要一个扩展的CDR3环，这种扩展的CDR3环在大多数纳米抗体中不常见，而在靶向GPCR的纳米抗体中普遍存在。结合实验和计算方法，绘制了一个抑制ACKR3-VUN701的界面，并定义了GPCR失活的独特构象机制。该项研究结果提供了对A类GPCR-纳米抗体选择性的见解，并为开发这些新的治疗工具提供了策略。

GPCR纳米抗体开发背景

超过800种人类G蛋白偶联受体（GPCR）允许整个身体的细胞对无数的细胞外信号作出反应。对这些受体的微调控制使它们成为最丰富的一类治疗靶点。然而，只有八分之一的人类GPCR被目前的治疗策略成功靶向。虽然小分子和多肽最广泛地用于治疗靶向GPCR，但需要新的分子来靶向剩余的受体。单克隆抗体（mab）是一类成功的生物药物，已被探索作为克服GPCRs治疗靶向挑战的手段。在过去的4年里，FDA批准了两种GPCR导向的单抗药物（erenumab-CGRP-R, mogamulizumab-CCR4）。尽管取得了一些成功，单抗的扩展结合表面并不总是适合于选择性识别膜嵌入GPCR展示的相对较小的细胞外表位。最近对407种抗GPCR抗体的评估显示，只有61%（248种）具有靶向性，这加剧了与GPCR生物药物开发相关的挑战。

可变结构域仅重链免疫球蛋白（VHH，也被称为纳米抗体）有可能弥合单克隆抗体和小分子之间的差距。这些小的抗体（12-15 kDa）使用三个互补决定区（CDR）的较小的抗体决定簇结合GPCR表位，这些表位更难被单克隆抗体靶向。2019年，首个纳米抗体药物卡普拉珠单抗（一种血管性血液病因子抑制剂）获得批准，加速了这类新型治疗分子的发展。靶向趋化因子受体CXCR4和CX3CR1两种GPCRs的纳米抗体目前正处于临床试验阶段。为了充分利用纳米抗体作为药理学工具和潜在药物的力量，了解纳米抗体如何结合细胞外GPCR表位并改变受体信号传导将是非常重要的。

主要研究内容

利用生物发光共振能量转移（BRET）检测GPCR激活，Schlimgen等[1]人表征了纳米抗体（VUN701）针对非典型趋化因子受体3（ACKR3）的受体特异性，建立了VUN701作为具有细胞外治疗潜力的竞争性ACKR3抑制剂。通过求解VUN701的溶液结构，Schlimgen等[1]人发现了一个不寻常的基序，使其能够抑制。虽然在大多数纳米抗体结构中不常见，但这种独特的基序是GPCR靶向纳米抗体的常见特征。Schlimgen等[1]人绘制了抑制ACKR3- VUN701的界面，并确定了抑制ACKR3和其他GPCR的分子机制。这些结果为纳米抗体如何抑制GPCR提供了结构性的见解，并为开发具有多种用途的强大工具提供了策略。

图1 内源性配体CXCL11和CXCL12对基于BRET的ACKR3 β arrestin2募集实验（虚线）。VUN701竞争试验，在指示的趋化因子浓度下增加VUN701（实线）

利用BRET法检测β-arrestin2向ACKR3募集，结果显示VUN701抑制CXCL11依赖性信号通路，IC50=105 nM，VUN701也抑制CXCL12的激活，IC50=157 nM。

图2 在VUN701增加的情况下ACKR3的剂量依赖性激活（剂量响应曲线镶嵌child-plot）

CXCL12诱导的β-arrestin2向ACKR3募集的Schild分析显示，VUN701以浓度依赖的方式改变CXCL12的效价，而不改变CXCL12 β-arrestin2募集的斜率或最大效率。

图3 CXCR4（灰色）和CXCR3A（黑色）基于BRET的β-arrestin2实验，CXCL12和CXCL11增加（虚线），趋化因子竞争实验，WT VUN701增加（实线）

与ACKR3最相似的CXCR4或CXCR3分别是CXCL12和CXCL11的受体。VUN701在高达10μM的浓度下无法抑制趋化因子-GPCR对β-arrestin2的募集。

图4 基于ACKR3-BRET的β-arrestin2实验显示CXCL12（灰色）增加，3.3 nM CXCL12的竞争实验显示WT VUN701（黑色）增加，CDR variantsΔCDR1（蓝色）、ΔCDR2（绿色）和ΔCDR3（红色）显示由于CDR重要触点的删除而导致IC50的改变

结果显示，虽然ΔCDR1和ΔCDR2突变体保留了结合和抑制ACKR3的能力，但ΔCDR3突变体导致几乎完全失去抑制功能，VUN701的扩展CDR3区域为主要结合GPCR的抗体表位。这些结果为治疗性中和纳米抗体开发提供了结构性的见解（主要机制为阻断配体和GPCR受体的结合），并为开发具有多种用途的强大工具提供了思路。

综上所述，在基于细胞的实验中，CXCL11和CXCL12功能的抑制以及CXCL12的Schild分析表明，VUN701是一种选择性、可逆的竞争性拮抗剂。VUN701与CXCL11和CXCL12的直接竞争表明这两个配体具有重叠的正交表位。VUN701通过扩展CDR3实现高亲和力的GPCR相互作用，以阻断配体与GPCR的结合，从而达到某种信号通路的阻断/抑制作用，为治疗性中和抗体药物单抗的开发提供创新性策略。

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参考文献

[1] Schlimgen, R.R., Peterson, F.C., Heukers, R. et al. Structural basis for selectivity and antagonism in extracellular GPCR-nanobodies. Nat Commun 15, 4611 (2024).

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