基于适配体构建电化学传感器实现军团菌超高灵敏度检测-适配体发现技术专题-泰克生物

基于适配体构建电化学传感器实现军团菌超高灵敏度检测

一．前言

嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性致病菌，会造成呼吸道感染，严重时会导致肺炎和多器官衰竭，因此人们不断开发能够在各种环境中快速、准确检测出嗜肺军团菌的方法。传统检测方法有多种，但是都存在相关问题。Aysha Shaukat等人首次通过Cell-SELEX技术筛选出高特异性适配体AY-19，基于该适配体研究出一种电化学平台，用于无标记、灵敏、特异性和快速检测嗜肺乳杆菌SG-1。

二．研究亮点—适配体+化学传感强强联合

1. 确定适配体—Cell-SELEX筛选

如图1（a）所示，在每轮筛选中将ssDNA文库与嗜肺乳杆菌SG-1共孵育，经过洗涤除去未结合ssDNA，回收结合的DNA。随后对结合的 DNA 进行 PCR 扩增和纯化形成下一个循环新的起始文库。图1（b）中可看到前五轮循环中结合的ssDNA荧光值不断地增强，在第五轮循环他们引入与SG-1密切相关的亚种进行反向筛选，消除非特异性结合，以增强适配体的特异性。最后对第10轮洗脱的 ssDNA进行测序。

图1 Cell-SELEX模式图以及每个循环中洗脱的ssDNA荧光强度值

他们进一步研究分析测序结果，通过使用多序列比对软件PRALINE对选定的ssDNA序列（引物结合位点后的 40个核苷酸）进行比对。得到结果如图2所示，为清晰明了作者使用红色字体作为突出显示每个序列中的保守区域，使用箭头符号显示九个进一步研究结合亲和力的序列。

图2 与SG-1结合的保守序列

2. 研究适配体表征

他们使用荧光标记法，在选中的这九个序列的5'端用FITC标记，然后将这九个特定浓度的适配体与固定数量的SG-1孵育，洗去未结合的适配体后，通过测量荧光强度来量化结合了多少适配体。图3显示了6种适配体的结果，根据平衡解离常数（Kd）就是达到一半最大结合量时所需的适配体浓度来解读，可以看到Kd范围在14-75 nM之间，其中AY-19 最低为14.19 nM，说明其结合力最强。

图3 通过荧光标记法Kd值量化适配体的结合力

3. 传感器的构建

他们选用AY-19制造电化学适配传感器。如图4所示，将AY-19进行硫醇化修饰（在一端加上-SH基团）并滴涂到金电极表面。在室温下孵育过夜后，-SH基团将会与金（Au）通过Au-S键连接，从而AY-19会直立固定在电极的表面。固定完适体后，电极表面还有裸露的金区域，这些区域会非特异性地吸附其他物质，造成假阳性信号，因此，需要用小分子6-巯基己醇（MCH）来“封闭”这些空位。

图4电化学适配传感器的制造模式图

为了验证上述制作步骤是否成功，Aysha Shaukat等人使用了一个叫做【Fe（CN）6】3-/4-的氧化还原探针分子来“试探”电极表面的情况。电极表面越轻易让电子通过，电流就越大；表面修饰物越多、负电荷越多，电子就越难传递，电流就越小，阻抗就越大。可以看到随着表面修饰物的增多，电流量降低（图5 a），电阻抗在增大（图5b），说明适体和MCH被成功地固定在电极表面。

图5传感器构建过程的表征

4.电化学检测

为了验证传感器实际应用中的灵敏度，他们通过调节SG-1的浓度来检测结合力，得到结果如图6（a）所示，随着他们不断提高SG-1的浓度，可以看到金属表面通过的电流量在降低，并且结合的细菌越多下降的越明显。右图是他们将电流变化值和细菌浓度的对数值之间的关系作图，得到一条线性直线，检测极限为4.6 CFU/mL极其灵敏。

图6电传感器检测性能

为了进一步验证该电传感适配器的特异性，他们做了交叉反应实验。在SG-1的基础上加入各种军团菌属进行检测，得到结果如图7所示发现与仅有SG-1 进行的测定相比，其他细菌的存在对结果没有明显影响，验证了其准确可靠的病原体检测潜力。

图7 使用几种军团菌属对传感器进行特异性检测

该研究通过Cell-SELEX技术获得九条候选序列，其中AY-19表现出最高亲和力，其Kd值低至14.19 nM，AY-19形成典型的茎环结构，比传统抗体稳定性好，特异性强与近缘菌种无交叉反应。因此AY-19被设想制备电化学传感器用于检测SG-1，灵敏度极高，检测最低值为4.6 CFU/mL，远优于现有多数方法。

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参考文献

[1] Shaukat, A., Chrouda, A., Sadaf, S. et al. Author Correction: Cell-SELEX for aptamer discovery and its utilization in constructing electrochemical biosensor for rapid and highly sensitive detection of Legionella pneumophila serogroup 1. Sci Rep 14, 15951 (2024).

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