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酵母cDNA表达文库构建服务

一个库容充足、多样性高、质量稳定的酵母cDNA文库，是成功进行酵母杂交、表面展示等下游功能筛选的决定性第一步。泰克生物凭借在酵母系统领域的深厚经验，为您提供专业可靠的cDNA文库构建解决方案。

泰克生物（TekBiotech）采用改进型SMART技术，并结合同源重组克隆策略，确保即使是微量的珍贵样本，也能构建出覆盖全面、偏向性低的高质量文库。无论您需要的是用于核系统筛选的pGADT7文库，还是定制化的展示文库，我们都能为您提供从RNA质检、文库构建到严格质控的一站式服务，助您的研究赢在起点。

█ cDNA展示文库构建服务

目前用到的cDNA文库构建方法有两种：SMART技术和Gateway技术。

SMART技术是由Clontech于1996年开发的，SMART技术全称为：Switching Mechanism At 5’ end of RNA Template，即RNA模板5’端转换机制的缩写，是利用反转录酶的模板切换活性，将特异性的序列加到cDNA的5’端，从而提高全长克隆的效率。

Gateway技术是由Invitrogen于1999年开发的，特点是在RNA模板序列两端引入同源重组臂，然后用同源重组（无缝克隆）的形式进行载体克隆，便捷之处在于更换目的序列的构建载体，进行不同宿主系统之间的载体穿梭。

利用上述两种方法均可以单独构建高质量的cDNA展示文库。泰克生物擅长利用SMART方法结合同源重组的方式（Gateway方法的同源方式）进行cDNA展示文库的构建工作。如图1所示，SMART方法合成cDNA文库：

酵母cDNA表达文库构建服务-泰克生物1.png

图1 SMART方法合成cDNA文库示意图

█ cDNA展示文库类型

根据客户的要求，泰克生物可以为客户提供均一化cDNA和非均一化cDNA文库构建服务。无论是什么类型的文库，客户均可以指定特定的载体（特定载体需要客户提供空白质粒以及图谱）进行文库构建。泰克生物能够为客户提供的cDNA文库类型如图2所示：

酵母cDNA表达文库构建服务-泰克生物2.png

█ 酵母cDNA展示文库构建

泰克生物为客户提供改进型的SMART cDNA文库构建服务。我们在SMART技术获得cDNA文库，通过在cDNA两端引入同源重组臂的方式进行任意载体的同源重组，借此技术可以获得原核类型的cDNA文库（更多详情请咨询我们的科学家）和真核酵母的cDNA文库，图3所示为酵母类型SMART技术构建的cDNA文库。

cDNA文库构建服务-泰克生物3.png

图3 基于改进型SMART技术的酵母展示cDNA文库

█ 酵母cDNA展示文库构建样品要求

客户可根据我们的要求进行样品的准备，也可以直接咨询我们的科学家进行详细沟通。如表1所示，样品准备要求：

样品类型	样品需求	保存条件（℃）	运输条件
细胞样本	细胞数量大于 2*10^7	-80	干冰
动物组织	需要按照我们的指导准备样品	-80	干冰
植物样本	需要按照我们的指导准备样品	-80	干冰
总 RNA	> 50 μg （3条带清晰可见)	-80	干冰

█ 酵母cDNA文库服务内容和周期

步骤	服务内容	周期
Step1：mRNA制备	(1) Total RNA提取（条带清晰可见，浓度>0.4ug/ul）； (2) mRNA纯化； (3) 交付：total RNA质量验证报告，mRNA质量验证报告；	1周
Step2：cDNA文库构建服务	(1) cDNA 合成与接头连接（三框文库）+cDNA 均一化（可选）； (2) 重组到酵母载体 pGADT7 上和电转化； (3) 将获得的 cDNA 文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增，获得初级文库； (4) 初级文库验证：单克隆测序进行均一化效果验证； (5) 交付： -- 初级cDNA文库，扩增文库质粒（>500ug）； -- 文库库容量 >1*10^7 CFU/ml； -- 平均插入片段 0.8-1.5 kb（不同项目有差异）； -- 实验报告，库容滴度结果，测序原始数据；	4-5周
Step3：酵母cDNA文库构建服务（可选）	(1) 初级文库进行酵母超级感受态制备电转化； (2) 文库库容鉴定+单克隆测序； (3) 交付： -- 原始酵母cDNA文库甘油菌; --文库库容量 >110^6 CFU/ml，文库滴度>210^7 CFU/ml; --实验报告，库容滴度结果，测序原始数据	3-5周

█ 酵母cDNA文库构建技术平台服务优势

质量双高标准

标准文库库容 > 1×10^7CFU，插入片段0.8-1.5 kb，可提供均一化处理，有效富集低丰度基因，杜绝高表达基因冗余。

灵活定制与平台兼容

支持pGADT7及客户指定载体上构建

可直接用于后续的酵母单/双杂交筛选

实现无缝对接。

全流程质控与交付

从RNA质量到最终库容，均有QC数据。交付完整材料包（质粒、甘油菌、详细报告及原始数据）实验记录完全可追溯。

珍稀样本处理

对RNA起始量要求极低

（最低仅需几微克），专长于处理临床、稀有组织等珍贵样本。

酵母cDNA表达文库构建服务常见问题解答

什么是酵母文库的构建？其中SMART技术是什么意思？

答：二十年来，酵母展示方法已成为发现、提高稳定性和亲和力成熟的各种蛋白质支架的常用工具，用于抗原识别。酵母展示特别适用于异二聚体蛋白的选择，例如抗体和T细胞受体（TCR），因为它允许通过间隙修复驱动的同源重组快速创建文库，并在相反交配类型的酵母交配后随后构建组合文库。酵母文库是由许多不同的基因克隆构成，这些基因克隆插入到载体中后，能够在酵母细胞内复制和表达。SMART扩增技术从生物体中提取总 RNA，并采用 RNA 模板 5' 端的转换机制（SMART）技术进行 cDNA 合成。随后，通过长距离 PCR 扩增双链 cDNA，在酵母菌株中纯化并与载体共转化。对构建的文库的质量参数进行评估，以验证构建的文库。
SMART技术的优点有什么？一般的应用是什么？

答：SMART技术即使客户的初始样本RNA的量很少的情况下，我们也可以高质量、高效的完成样本全长cDNA的扩增，这项技术比较适合低丰度表达基因进行克隆。通过一些技术手段的均一化处理后，我们能够发现SMART技术显著降低了基因的冗余度，帮助我们对那些表达量较低的基因进行了有效的富集，这样可以更好的提高我们构建的酵母文库中的基因多样性。SMART技术的操作流程更加简单，操作也更加快捷，有利于科研人员在实验室中快速开展实验。SMART技术利用反转录酶的模板切换活性，在cDNA的5'端加上特异性的序列，这样可以提高全长克隆的效率。泰克生物有严格的质控流程，通过质控流程，泰克生物使用SMART技术构建的酵母文库在库容量、平均插入片段长度以及克隆阳性率等方面均能达到较高的标准，泰克生物的科研人员能够构建出高质量、高可靠性的酵母文库，为客户不同生命科学领域的深入研究提供有力支持。
酵母文库构建服务中，SMART技术对RNA起始量的要求如何？

答：SMART技术之所以在分子生物学领域一直使用，其显著优势之一就是因为它对RNA起始量包容性强。在实验中，这项技术仅仅只需要极低的RNA起始量，通常仅需几微克（μg）的高质量RNA，便能启动并顺利完成复杂的文库构建流程。这一特点对于那些比较珍贵的样本，RNA样品难以获得的项目至关重要，比如说我们常见的稀有细胞类型分析、低丰度基因表达研究或者医院的临床样本资源有限的情况。如果遇到上述情况，SMART技术就能够大大的降低实验的门槛，不会让我们的实验被样本量所限制。尽管SMART技术要求的样本量很低，但是我们还是要注意RNA样本的质量如何，它的质量对于最终构建好的文库的多样性影响重大。因此，在使用SMART技术的情况下，也必须采用严格的RNA提取和纯化方法。
你们构建的酵母cDNA文库，能直接用于后续的酵母双杂交筛选吗？

答：完全可以。我们最常构建的文库即克隆于酵母双杂交通用AD载体（如pGADT7）中。交付的文库（质粒或酵母甘油菌）可直接用于您的后续互作筛选实验，实现“构建-筛选”一站式服务。如果您有特殊的载体需求，我们也可提供定制化构建服务。
我们样本非常珍贵，RNA量很少，你们能保证建库成功吗？

答：这正是我们技术的优势所在。我们采用的改进型SMART技术是专门为微量RNA样本优化的建库方法，仅需常规方法几分之一的RNA起始量（如几微克高质量总RNA）。
什么是“均一化”cDNA文库？我是否需要选择这项服务？

答：“均一化”是通过技术手段降低高丰度cDNA序列的拷贝数，从而显著提升低丰度和稀有转录本在文库中的发现几率。如果您的研究目标是发现新基因、或担心高表达基因会“淹没”目标信号，例如在进行大规模酵母双杂交筛选时，选择均一化文库能大幅提高筛选效率和深度。我们的科学家会根据您的具体研究目标，为您建议是否需要此项服务。
如何评估你们交付的cDNA文库质量？有哪些具体的质控数据？

我们交付的不仅是文库实物，更是完整的质量证据包，包括：1）库容量与滴度（具体CFU数值）；2）平均插入片段长度（电泳图或分析数据）；3）随机克隆测序报告（展示插入序列多样性）；4）必要时提供的均一化评估数据。所有质控标准和原始数据均可在实验报告中追溯。

什么是酵母文库的构建？其中SMART技术是什么意思？

答：二十年来，酵母展示方法已成为发现、提高稳定性和亲和力成熟的各种蛋白质支架的常用工具，用于抗原识别。酵母展示特别适用于异二聚体蛋白的选择，例如抗体和T细胞受体（TCR），因为它允许通过间隙修复驱动的同源重组快速创建文库，并在相反交配类型的酵母交配后随后构建组合文库。酵母文库是由许多不同的基因克隆构成，这些基因克隆插入到载体中后，能够在酵母细胞内复制和表达。SMART扩增技术从生物体中提取总 RNA，并采用 RNA 模板 5' 端的转换机制（SMART）技术进行 cDNA 合成。随后，通过长距离 PCR 扩增双链 cDNA，在酵母菌株中纯化并与载体共转化。对构建的文库的质量参数进行评估，以验证构建的文库。
SMART技术的优点有什么？一般的应用是什么？

答：SMART技术即使客户的初始样本RNA的量很少的情况下，我们也可以高质量、高效的完成样本全长cDNA的扩增，这项技术比较适合低丰度表达基因进行克隆。通过一些技术手段的均一化处理后，我们能够发现SMART技术显著降低了基因的冗余度，帮助我们对那些表达量较低的基因进行了有效的富集，这样可以更好的提高我们构建的酵母文库中的基因多样性。SMART技术的操作流程更加简单，操作也更加快捷，有利于科研人员在实验室中快速开展实验。SMART技术利用反转录酶的模板切换活性，在cDNA的5'端加上特异性的序列，这样可以提高全长克隆的效率。泰克生物有严格的质控流程，通过质控流程，泰克生物使用SMART技术构建的酵母文库在库容量、平均插入片段长度以及克隆阳性率等方面均能达到较高的标准，泰克生物的科研人员能够构建出高质量、高可靠性的酵母文库，为客户不同生命科学领域的深入研究提供有力支持。
酵母文库构建服务中，SMART技术对RNA起始量的要求如何？

答：SMART技术之所以在分子生物学领域一直使用，其显著优势之一就是因为它对RNA起始量包容性强。在实验中，这项技术仅仅只需要极低的RNA起始量，通常仅需几微克（μg）的高质量RNA，便能启动并顺利完成复杂的文库构建流程。这一特点对于那些比较珍贵的样本，RNA样品难以获得的项目至关重要，比如说我们常见的稀有细胞类型分析、低丰度基因表达研究或者医院的临床样本资源有限的情况。如果遇到上述情况，SMART技术就能够大大的降低实验的门槛，不会让我们的实验被样本量所限制。尽管SMART技术要求的样本量很低，但是我们还是要注意RNA样本的质量如何，它的质量对于最终构建好的文库的多样性影响重大。因此，在使用SMART技术的情况下，也必须采用严格的RNA提取和纯化方法。
你们构建的酵母cDNA文库，能直接用于后续的酵母双杂交筛选吗？

答：完全可以。我们最常构建的文库即克隆于酵母双杂交通用AD载体（如pGADT7）中。交付的文库（质粒或酵母甘油菌）可直接用于您的后续互作筛选实验，实现“构建-筛选”一站式服务。如果您有特殊的载体需求，我们也可提供定制化构建服务。
我们样本非常珍贵，RNA量很少，你们能保证建库成功吗？

答：这正是我们技术的优势所在。我们采用的改进型SMART技术是专门为微量RNA样本优化的建库方法，仅需常规方法几分之一的RNA起始量（如几微克高质量总RNA）。
什么是“均一化”cDNA文库？我是否需要选择这项服务？

答：“均一化”是通过技术手段降低高丰度cDNA序列的拷贝数，从而显著提升低丰度和稀有转录本在文库中的发现几率。如果您的研究目标是发现新基因、或担心高表达基因会“淹没”目标信号，例如在进行大规模酵母双杂交筛选时，选择均一化文库能大幅提高筛选效率和深度。我们的科学家会根据您的具体研究目标，为您建议是否需要此项服务。
如何评估你们交付的cDNA文库质量？有哪些具体的质控数据？

我们交付的不仅是文库实物，更是完整的质量证据包，包括：1）库容量与滴度（具体CFU数值）；2）平均插入片段长度（电泳图或分析数据）；3）随机克隆测序报告（展示插入序列多样性）；4）必要时提供的均一化评估数据。所有质控标准和原始数据均可在实验报告中追溯。

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