靶向肿瘤治疗新药物——肽偶联药物（PDC）在肝细胞癌模型中的疗效-噬菌体展示技术专题-泰克生物

靶向肿瘤治疗新药物——肽偶联药物（PDC）在肝细胞癌模型中的疗效

经导管动脉化疗栓塞术（TACE）已成为不可切除的晚期肝细胞癌（HCC）的首选治疗方法。然而，TACE对肿瘤供血动脉的栓塞往往会导致与缺氧相关的肿瘤血管生成，这限制了HCC的治疗效果。本研究中，Wangdeng等[1]人使用一种靶向血管内皮生长因子受体（VEGFR）的肽VEGF125-136（QKRKRKKSRYKS）与一种溶栓肽（KLUKLUKKLUKLUKLUK）结合，形成一种肽-药物结合物（PDC）。该研究使用细胞亲和性测定法检测该肽对高表达VEGFR的细胞系的结合能力，并使用CCK8和细胞凋亡来确认不同细胞系的细胞毒性，同时创建了一个VX2肿瘤荷瘤兔子模型，以评估该肽结合物与TACE联合应用在体内的抗肿瘤效果。该肽结合物不仅能靶向细胞表面的VEGFR并抑制VEGFR功能，而且具有强大的抗癌效果。该研究发现，这种肽结合物对肝癌细胞Huh7（IC50值为7.3±0.74 μM）和内皮细胞HUVEC（IC50值为10.7±0.292 μM）具有很强的细胞毒性，并诱导了这两种细胞系的细胞凋亡。此外，在VX2兔肿瘤模型中，这些肽通过TACE治疗显示出比传统药物DOX更好的体内抗肿瘤效果，并能有效抑制肿瘤组织中的血管生成，且安全性良好。该研究工作可能为通过TACE联合疗法进行临床肝癌治疗提供了一种替代方案。

肽偶联药物（PDC）设计和作用原理

在肿瘤组织中的抗血管生成已成为治疗经导管动脉化疗栓塞术（TACE）的关键策略。除了小分子药物外，许多肽配体也表现出对血管内皮生长因子受体（VEGFR）的良好结合亲和力，并已被广泛用于肿瘤的抗血管生成治疗或用于恶性肿瘤的放射性示踪剂。该研究选择了已报道的一种强效的VEGFR肽抑制剂VEGF125?136（QKRKRKKSRYKS，命名为QR）来抑制VEGF与VEGFR之间的相互作用。然而，这种肽的抑制效果并不足以抑制肿瘤的增殖。因此，我们选择了一种裂解肽（KLUKLUKKLUKLUK，命名为KLU）与这种VEGFR肽配体相结合，称为QR-KLU，如图1所示。这种设计的肽不仅可以抑制VEGFR信号通路，还可以通过非特异性膜破坏来抑制肿瘤的增殖。这种设计的肽偶联物可以与TAE结合用于肝细胞癌（HCC）的治疗，成为一种新型且有效的药物。

图1 QR-KLU肽结合物的设计图

QR-KLU肽与内皮细胞的亲和力

该研究进行了细胞竞争性结合试验，以评估肽结合物与高表达血管内皮生长因子受体（VEGFR）的内皮细胞（HUVEC）的亲和力。用FAM标记的VEGF125?136肽QR与HUVEC细胞共培养4小时，然后通过流式细胞术检测细胞穿透能力。如图2A所示，在0 μM的QR-KLU处理下，FAM标记的肽QR显示出强大的细胞穿透能力，但随着QR-KLU浓度的增加，FAM标记的肽QR的细胞穿透能力下降。这些结果表明，在低浓度下，QR-KLU能够与VEGF肽竞争细胞表面的VEGFR结合，这表明肽QR-KLU与内皮细胞的结合亲和力很强。为了进一步证实以上结果，该研究使用HT29细胞（HT29胞中VEGFR的表达较低）重复了该试验，结果发现与HUVEC细胞相比，FAM标记的QR肽在HT29细胞中的细胞穿透能力更低（如图2B、C所示）。此外，不同浓度的QR-KLU肽对FAM标记的肽QR的细胞穿透能力没有明显影响。所有这些数据都表明，QR-KLU肽对高度表达血管内皮生长因子受体（VEGFR）的内皮细胞具有更强的亲和力。

图2 QR-KLU 与不同细胞系的细胞亲和力

QR-KLU肽的细胞毒性

通过CCK8测定法评估了肽结合物QR-KLU对Huh7和HUVEC细胞增殖的影响。首先，我们研究了三种肽（QR、KLU和QR-KLU）在不同浓度下对Huh7和HUVEC细胞的抗增殖能力。如图3A、B所示，分别用QR肽、KLU肽、QR-KLU肽、不同浓度的DOX处理细胞。在两种细胞系中，KLU和QR-KLU组的抑制率均呈剂量依赖性增加。在HUVEC细胞中，肽QR-KLU（IC50为10.7±0.292μM）显示出比KLU（IC50为33.8±0.98μM）更强的抑制作用；在Huh7细胞中，QR-KLU（IC50为7.3±0.74μM）也显示出比KLU（IC50为36.27±2.7μM）更强的抗肿瘤作用。同时，肽QR在80μM条件下显示出微不足道的毒性。正如预期的那样，DOX在两种细胞系中表现出最强的细胞毒性（Huh7细胞的IC50为0.243±0.076μM，HUVEC细胞的IC50为2.12±0.72μM）。所有这些数据表明，QR-KLU在体外具有一定的细胞毒性。所有以上结果表明，该研究设计的肽结合物QR-KLU能够显著抑制癌细胞或内皮细胞的增殖。

图3 QR-KLU肽的细胞毒性验证结果

QR-KLU对Huh7和HUVEC细胞凋亡的影响

通过流式细胞术进行的Annexin V-PI染色进一步证实了QR-KLU改进后的促凋亡活性。活细胞、早期凋亡细胞、坏死细胞、晚期凋亡细胞分别用Q4、Q3、Q2和Q1表示。在10μM的浓度下，肽QR-KLU在Huh7细胞中显示出显著的促凋亡作用，凋亡率超过60%，在HUVEC细胞中超过40%，如图4所示。此外，QR-KLU以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡。然而，在80μM的浓度下，肽QR在Huh7细胞和HUVEC细胞中均未显示出明显的促凋亡作用。在20μM的KLU肽浓度下，Huh7细胞和HUVEC细胞中的凋亡细胞百分比约为25%。

图4 QR-KLU对Huh7和HUVEC细胞凋亡影响验证

肿瘤生长

该研究建立VX2兔肿瘤模型进行TAE治疗，NS、DOX、KLU和QR-KLU四组的平均肿瘤体积分别为930.7±461.1、889.0±317.7、991.8±114.2和899.7±394.0 mm^3（如图5A所示）。在TAE治疗7天后，四组的平均肿瘤体积分别为2540.5±1173.8、1382.9±563.7、1321.4±210.4和1008.5±370.7立方毫米。NS组的肿瘤体积显著增加，平均增长率为276.4%，但DOX、KLU和QR-KLU组的肿瘤生长率显著低于NS组（P值<0.001），如图5B所示。值得注意的是，QR-KLU组的平均肿瘤生长率显著低于其他三组（P值<0.01），但klu组和dox组之间没有显著差异（p>0.05）。

图5 QR-KLU抑制肿瘤的生长验证结果

该研究为肝细胞癌（HCC）的经导管动脉化疗栓塞（TACE）治疗提供了新的选择。与传统的化疗药物相比，肽 QR-KLU具有更强的抗肿瘤活性和抗血管生成作用，并且安全性良好。因此，肽QR-KLU在肝癌的TACE治疗中具有广阔的应用前景，值得进一步思考和研究。

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参考文献

[1] Wang, D., Liu, J., Li, T. et al. A VEGFR targeting peptide-drug conjugate (PDC) suppresses tumor angiogenesis in a TACE model for hepatocellular carcinoma therapy. Cell Death Discov. 8, 411 (2022).

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