酶蛋白进化酵母展示服务-泰克生物-酵母展示服务专家

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酶蛋白进化酵母展示服务

泰克生物致力于为客户提供高质量的酶蛋白酵母展示服务，为客户的后续的酶蛋白活性验证、功能酶蛋白的筛选（流式筛选）、高活性酶蛋白的开发以及蛋白酶的体外定向进化等下游研发工作提供有力支持。泰克生物在酶酵母展示方面拥有多年的项目开发经验和心得，能够为客户提供各种定制化的酶酵母展示服务，包括但不限于单个酶展示、trimer codon突变酶文库展示、NNK突变酶文库展示、error-prone PCR突变酶文库展示等多种酶酵母展示服务。

█ 基于酵母表面展示技术的开发服务

泰克生物可为客户提供基于酵母表面展示技术的酶蛋白等进化开发服务。通过trimer codon，NNK技术合成特定位点突变的组合蛋白酶突变基因文库，利用PCR技术将来上述突变体基因插入到凝集素Aga2p基因的末端进行融合表达，如图1所示，Aga2p蛋白亚基通过两个二硫键与固定在酵母细胞壁上的Aga1p 蛋白亚基结合，可以结合流式分选技术，将靶向底物的高亲和力的序列优先筛选出来。

酶蛋白酵母展示原理示意图-泰克生物.png

图1 酶蛋白酵母展示原理示意图

基于酵母展示技术（Yeast Display Technology），泰克生物能够为客户提供高质量的蛋白酶突变体开发服务，文库库容达10^8，文库多样性、插入率、阳性率均可达90%以上，满足10-12个氨基酸位点饱和突变或组合突变频率不超过10^8次方的酶蛋白序列优化需求。

█ 酶蛋白酵母展示突变体进化开发服务

泰克生物建立了完善的酵母展示体系，能够提供各种高质量的定制化的酵母展示服务：蛋白酵母展示、酶酵母展示、酶突变文库酵母展示等，满足不同客户的研究需求。酶蛋白突变文库酵母筛选服务流程如图2所示。

酶基因随机突变文库酵母展示服务流程-泰克生物.png

图2酶基因随机突变文库酵母展示服务流程

█ 服务内容和周期

步骤	服务内容	周期
Step1：酶蛋白酵母展示（预实验）	1、蛋白酶基因合成+PCR扩增目的基因； 2、载体构建与转化：蛋白酶基因拼接酵母展示载体，电击转化酵母菌株； 3、菌株PCR验证； 4、交付：展示酵母菌株以及诱导培养物，标准实验报告	4-5周
Step2：酶蛋白突变文库酵母展示	1、采用trimer codon技术/NNK技术/error-prone PCR技术构建gene pool 2、构建酵母载体gene pool 3、载体构建与转化：电击转化酵母菌株； 4、随机挑单克隆进行菌株PCR验证+文库NGS测序验证； 5、文库交付	4-6周
Step3：酶蛋白突变文库筛选	1、荧光标记蛋白FACS筛选； 2、根据要求进行不同亲和力群体NGS测序；同时挑单克隆诱导表达+酶活检测； 3、阳性克隆进行基因测序；	4-6周

酵母展示技术为酶蛋白或其他类型的蛋白进化研究工作提供一种高通量，方便且快捷的研究方式，泰克生物通过多年的研究积累，借助于酵母展示技术平台切实为我们的客户提供了行之有效的酶蛋白进化有效开发方法，能够为客户节省费用和时间成本。

█ 酶蛋白酵母表面展示技术平台服务优势

适合于绝大部分酶蛋白的突变体研究，疏

水性序列展示情况优秀

轻松设置对应于亲本序列的筛选阈值，易

获得底物亲和力更好的候选序列

一次实验解决10^8以内的突变体序列验证

要求

█ 酶蛋白酵母展示服务优势

多种酶展示可选：酶蛋白、trimer codon突

变文库、NNK突变文库、error-prone PCR

突变文库等

酶酵母展示技术成熟：酶突变文库库容可

达10^8-10^9

实验记录可追溯：文库QC质控标准，中英

文实验报告，原始实验记录

一对一个性化方案定制，根据客户需求设

计最佳的构建方案，满足各类客户的科研

项目需求

酶蛋白进化酵母展示服务常见问题解答

什么是酶酵母展示技术？

答：微生物细胞表面显示技术为工程化具有增强特性的蛋白质/多肽提供了强大的平台。与传统的细胞内和细胞外表达（分泌）系统相比，该技术避免了酶纯化、底物转运过程，是酶不稳定的有效解决方案。在细胞表面展示平台中，不同的酶可以位于同一细胞表面，并且接近可以提高它们的协同作用。直接细胞表面显示是一种简单而有效的策略。当具有协同作用的多种酶共同展示时，各种酶的比例不能得到很好的控制。支架介导的表面显示系统可以弥补直接显示系统的不足，缩短底物的转移距离，增强酶之间的邻近效应。然而，设计更复杂，无法保证电池表面的组装稳定性。
酶酵母展示技术的影响因素有什么？

答：酶在细胞表面的显示效率与附着的锚定蛋白有关。已经尝试通过筛选对比鲜明的新锚定蛋白来提高细胞表面显示效率。通过计算预测从不同来源选择了37个GPI型锚蛋白，与yEGFP 融合，通过比较荧光强度进行预筛选，并进一步将几种强效荧光锚蛋白与β-葡萄糖苷酶融合以确定酶活性。最后，发现来自乳酸克鲁维酵母的6Kl具有更高的转录水平和卓越的靶蛋白显示效率。通过比较几种显示系统的显示效率和酶活性，研究人员使用α-半乳糖苷酶作为靶酶并将其直接与 Aga1p 融合，对a-凝集素锚定系统进行了调整，以开发一种新的表面显示系统。该酶还与传统的α-凝集素和选定的其他六种锚定蛋白融合。酶活性比较显示，Aga1p 、Dan4p和Sed1p具有很高的显示效率，并且是将重组蛋白固定在酵母表面的有前途的锚定系统。锚定蛋白结构域的显示效率随所显示蛋白质的分子量而变化。通过优化启动子和信号肽的组合，可以进一步改善酶的表达。在锚蛋白和靶蛋白之间添加适当长度的接头肽似乎有助于将蛋白质的活性部分与细胞壁分离，为底物进入创造空间并提高展示酶的活性。
各种酶在酵母表面表达的应用及作用是什么？

答：将纤维素水解成葡萄糖至少需要三种纤维素酶：内切葡聚糖酶（EG）、纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BGL）。这三种酶已成功显示在酵母的细胞表面，将纤维素水解为葡萄糖。EGII和 TaCBHI放在同一空间（在细胞表面或培养基中）有助于无定形纤维素基乙醇的发酵。工程酵母证明，这两种酶以及其他两种酶作用于无定形纤维素和结晶纤维素，表现出更高的乙醇产量。已经进行了许多尝试来改进发酵过程并引入新的木质纤维素降解酶，以进一步提高纤维素的降解和产品产量。木聚糖通过预处理过程，它比纤维素更容易降解成单体，随着细胞表面显示工程的逐渐成熟和木糖代谢酶的异源表达，工程酵母可以实现木聚糖同化的一步过程。利用木糖的酵母可以通过引入编码与木糖同化途径相关的酶的基因来构建。构建了一系列多功能微型半纤维素小体，用于阿拉伯木聚糖的水解。淀粉是α-D-葡萄糖的一种聚合物，并且在许多农业和工业废料中大量存在。利用表面显示工程酵母降解淀粉原料，不仅可以生产生物燃料，还可以提高食品工业的工艺质量。脂肪酶可催化多种反应，在工业上应用广泛。通过使用工程酵母细胞，在细胞表面显示脂肪酶作为可回收的生物催化剂，可以降低生产成本。
酶酵母展示过程中存在的问题是什么？怎样解决这些问题？

答：异源蛋白生产效率低下导致工程酵母菌株缺乏活性，随着回收时间的增加，工程酵母的活性可能会降低得更多。目前的研究大多主要在实验室水平，需要进一步研究构建的工程菌株是否适合工业化大规模。为解决上述瓶颈，以后我们应开发更多新型锚定蛋白来扩展细胞表面可显示位点，并设计新的基因编辑系统结合细胞表面显示，以增加靶基因的拷贝数并简化质粒转化过程。应开发更多用于封装工程酵母的生物材料，以增加再利用次数，保持显示蛋白的活性，并进一步扩大应用领域。通过合理和系统的设计构建酵母细胞表面展示系统。细胞表面显示技术、代谢工程和合成生物学工程的结合有助于减少副产物的产生，构建多功能的“超级酵母”。
如何为工业酶生产选择最佳的酵母菌宿主物种？

答：生产重组酶的挑战性任务之一是酵母宿主的选择。尽管酿酒酵母一直是广泛研究的主题，并且目前是生产生物制剂的首选宿主之一，但通常获得的产量使其无法用于生产散装酶。预测最合适的宿主仍然是不可能的，相反，尽可能筛选多个宿主是标准方法。根据经验，宿主在分类学上应尽可能与供体生物体密切相关（即酶基因的来源）。这样，重组宿主对细胞机制（分泌、蛋白质折叠等）的要求应该有些相似。尽管希望能够生产多种酶，但现实仍然表明，单个宿主只能产生有限份额的“蛋白质宇宙”。选择宿主物种时的另一个考虑因素是内源性蛋白酶的水平，因为它会影响产物的产量和稳定性。显然，在发酵过程中，若宿主菌株释放大量蛋白酶，会导致酶产量并不理想。所选菌株要适应从小规模实验到大规模工业生产。这将使数千种菌株的测试成为可能，以选择最合适的发酵放大候选菌株。

什么是酶酵母展示技术？

答：微生物细胞表面显示技术为工程化具有增强特性的蛋白质/多肽提供了强大的平台。与传统的细胞内和细胞外表达（分泌）系统相比，该技术避免了酶纯化、底物转运过程，是酶不稳定的有效解决方案。在细胞表面展示平台中，不同的酶可以位于同一细胞表面，并且接近可以提高它们的协同作用。直接细胞表面显示是一种简单而有效的策略。当具有协同作用的多种酶共同展示时，各种酶的比例不能得到很好的控制。支架介导的表面显示系统可以弥补直接显示系统的不足，缩短底物的转移距离，增强酶之间的邻近效应。然而，设计更复杂，无法保证电池表面的组装稳定性。
酶酵母展示技术的影响因素有什么？

答：酶在细胞表面的显示效率与附着的锚定蛋白有关。已经尝试通过筛选对比鲜明的新锚定蛋白来提高细胞表面显示效率。通过计算预测从不同来源选择了37个GPI型锚蛋白，与yEGFP 融合，通过比较荧光强度进行预筛选，并进一步将几种强效荧光锚蛋白与β-葡萄糖苷酶融合以确定酶活性。最后，发现来自乳酸克鲁维酵母的6Kl具有更高的转录水平和卓越的靶蛋白显示效率。通过比较几种显示系统的显示效率和酶活性，研究人员使用α-半乳糖苷酶作为靶酶并将其直接与 Aga1p 融合，对a-凝集素锚定系统进行了调整，以开发一种新的表面显示系统。该酶还与传统的α-凝集素和选定的其他六种锚定蛋白融合。酶活性比较显示，Aga1p 、Dan4p和Sed1p具有很高的显示效率，并且是将重组蛋白固定在酵母表面的有前途的锚定系统。锚定蛋白结构域的显示效率随所显示蛋白质的分子量而变化。通过优化启动子和信号肽的组合，可以进一步改善酶的表达。在锚蛋白和靶蛋白之间添加适当长度的接头肽似乎有助于将蛋白质的活性部分与细胞壁分离，为底物进入创造空间并提高展示酶的活性。
各种酶在酵母表面表达的应用及作用是什么？

答：将纤维素水解成葡萄糖至少需要三种纤维素酶：内切葡聚糖酶（EG）、纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BGL）。这三种酶已成功显示在酵母的细胞表面，将纤维素水解为葡萄糖。EGII和 TaCBHI放在同一空间（在细胞表面或培养基中）有助于无定形纤维素基乙醇的发酵。工程酵母证明，这两种酶以及其他两种酶作用于无定形纤维素和结晶纤维素，表现出更高的乙醇产量。已经进行了许多尝试来改进发酵过程并引入新的木质纤维素降解酶，以进一步提高纤维素的降解和产品产量。木聚糖通过预处理过程，它比纤维素更容易降解成单体，随着细胞表面显示工程的逐渐成熟和木糖代谢酶的异源表达，工程酵母可以实现木聚糖同化的一步过程。利用木糖的酵母可以通过引入编码与木糖同化途径相关的酶的基因来构建。构建了一系列多功能微型半纤维素小体，用于阿拉伯木聚糖的水解。淀粉是α-D-葡萄糖的一种聚合物，并且在许多农业和工业废料中大量存在。利用表面显示工程酵母降解淀粉原料，不仅可以生产生物燃料，还可以提高食品工业的工艺质量。脂肪酶可催化多种反应，在工业上应用广泛。通过使用工程酵母细胞，在细胞表面显示脂肪酶作为可回收的生物催化剂，可以降低生产成本。
酶酵母展示过程中存在的问题是什么？怎样解决这些问题？

答：异源蛋白生产效率低下导致工程酵母菌株缺乏活性，随着回收时间的增加，工程酵母的活性可能会降低得更多。目前的研究大多主要在实验室水平，需要进一步研究构建的工程菌株是否适合工业化大规模。为解决上述瓶颈，以后我们应开发更多新型锚定蛋白来扩展细胞表面可显示位点，并设计新的基因编辑系统结合细胞表面显示，以增加靶基因的拷贝数并简化质粒转化过程。应开发更多用于封装工程酵母的生物材料，以增加再利用次数，保持显示蛋白的活性，并进一步扩大应用领域。通过合理和系统的设计构建酵母细胞表面展示系统。细胞表面显示技术、代谢工程和合成生物学工程的结合有助于减少副产物的产生，构建多功能的“超级酵母”。
如何为工业酶生产选择最佳的酵母菌宿主物种？

答：生产重组酶的挑战性任务之一是酵母宿主的选择。尽管酿酒酵母一直是广泛研究的主题，并且目前是生产生物制剂的首选宿主之一，但通常获得的产量使其无法用于生产散装酶。预测最合适的宿主仍然是不可能的，相反，尽可能筛选多个宿主是标准方法。根据经验，宿主在分类学上应尽可能与供体生物体密切相关（即酶基因的来源）。这样，重组宿主对细胞机制（分泌、蛋白质折叠等）的要求应该有些相似。尽管希望能够生产多种酶，但现实仍然表明，单个宿主只能产生有限份额的“蛋白质宇宙”。选择宿主物种时的另一个考虑因素是内源性蛋白酶的水平，因为它会影响产物的产量和稳定性。显然，在发酵过程中，若宿主菌株释放大量蛋白酶，会导致酶产量并不理想。所选菌株要适应从小规模实验到大规模工业生产。这将使数千种菌株的测试成为可能，以选择最合适的发酵放大候选菌株。

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