采用环境敏感报告因子对PROTAC介导的蛋白质降解进行无创体内监测-噬菌体展示技术专题-泰克生物

采用环境敏感报告因子对PROTAC介导的蛋白质降解进行无创体内监测

蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis targeting chimeras，PROTACs）是一项突破性的治疗技术，用于选择性降解感兴趣的蛋白（POIs）。PROTACs的结构变化不可预测地影响了其蛋白质降解效率，这主要是通过western blotting定量POIs丰度来评估的。然而，这种方法无法实现对活细胞内蛋白质降解的非侵入性监测，更不用说直接评估体内的降解效果了。因此，Li等[1]人开发了一种环境敏感报告因子（ESR），用于定量体内由PROTACs触发的蛋白质降解事件。通过同时整合POIs靶向配体和环境敏感荧光团，ESR信号与POIs水平表现出很强的荧光相关性。这种无创监测报告提供了一种高通量且方便的方法来筛选靶向降解物的POIs，并预测PROTACs介导的小鼠模型的治疗结果。ESR策略有潜力作为一种通用的模块化方案，用于非侵入性定量癌症相关治疗靶点的蛋白质降解，同时，为未来癌症的有效治疗和检测提供理论依据和思路。

PROTACs介导的蛋白质降解的ESR设计和机制

ESR是一种异双功能分子，由三个关键元素组成：POIs靶向配体、环境敏感荧光团和促进两者连接的短连接体linker（图1a）。在极性水环境中，ESR分子自由旋转，通过非辐射跃迁释放激发态的能量，产生微弱的荧光信号。然而，当在POIs靶向配体的引导下与POIs结合时，ESR分子的扭转运动被限制在POIs的非极性疏水结合口袋内，减少了非辐射跃迁，显著增强了荧光信号（图1b）。这种机制为量化POIs表达提供了一种精确的方法。通过同时整合POIs靶向配体和环境敏感荧光团，ESR信号与POIs水平表现出很强的荧光相关性。为了验证方法的有效性和普遍性，该研究基于环境敏感荧光团尼罗红骨架合成了两个报告因子（JQ1-NR和ML-NR），用于非侵入性定量癌症相关治疗蛋白（BRD4和GPX4）的表达。此外，ESR策略简化并加速了POIs降解剂的筛选。利用ESR策略，该研究以POIs水平为介质，探索PROTACs在体内的治疗效果与ESR荧光变化之间的相关机制（图1c）。这些特性使ESR策略成为一种通用的模块化框架，可通过荧光成像对多种癌症相关治疗蛋白进行无创监测。

图1 无创定量体内PROTACs介导的蛋白质降解的ESR设计和机制

ESR的设计和表征

为了验证策略的可行性，本研究初步测量了亚甲基蓝（MB）、荧光素（FL）、罗丹明B（RB）和尼罗红（NR）等各种荧光团在不同溶剂中的光谱响应，考察其对环境变化的敏感性（图2a）。溶剂极性使用Lippert-Mataga极性参数Δ?进行量化（图2b）。MB、FL和RB在各种溶剂中的光学性质是随机的，但NR的荧光强度随溶剂极性的增加而降低。NR的荧光强度与溶剂极性之间有很好的相关性（r=-0.8515，P=0.0073）（图2c，d）。环境因子的改变还包括酸碱状态（pH），NR可以特异性地感知环境极性的变化，而不受pH干扰的影响，是开发ESR系统的理想选择。

图2 ESR的设计和表征

ESR定量体外PROTACs介导的蛋白质降解

为了量化降解过程中BRD4蛋白的表达，初步合成了一种先前报道的BET蛋白降解剂，命名为JV8（图3a）。4T1细胞暴露于不同浓度的JV8（0-100 nM）中24小时，使用WB测量降解效果。总细胞和细胞质中的BRD4水平均呈剂量依赖性下降，即使在最高测试浓度下，细胞核中BRD4的降解也最小（图3b，c）。然后我们利用蛋白酶体抑制剂MG132探索了JV8的蛋白质降解机制。该抑制剂有效阻断26S蛋白酶体复合物的蛋白水解活性，影响细胞内蛋白降解。MG132的加入阻碍了BRD4蛋白的降解，验证了JV8由泛素-蛋白酶体系统控制的降解机制（图3d）。免疫荧光染色进一步证实JV8优先降解细胞质中的BRD4（图3e），与WB结果一致。此外，BRD4降解剂JV8比蛋白配体JQ1（+）诱导的凋亡程度更大（图3f）。

图3 ESR定量体外PROTACs介导的蛋白质降解

通过流式细胞术分析探索JQ1-NR在活细胞中的摄取平衡(图4a，b)。JQ1-NR的饱和浓度为2 μM，最佳孵育时间为1 h。为了确定JQ1-NR是否可以用于BRD4表达的无创定量，将4T1细胞分别孵育为不同的组（图4c）。BET蛋白配体JQ1（+）的存在导致JQ1-NR荧光信号比游离NR荧光团更强。JV8预处理4T1细胞显著降低了JQ1-NR信号，类似于游离NR荧光团，这是由于JV8引发BRD4蛋白降解。该研究进一步证实，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到，加入JV8后，活细胞细胞质中的JQ1-NR信号呈剂量依赖性和时间依赖性下降（图4d、e）。为了探究不同细胞区域BRD4蛋白水平与JQ1-NR信号的相关性，使用流式细胞术定量全细胞的JQ1-NR信号（图4f），并分别与各细胞区域WB的BRD4蛋白定量结果进行线性分析（图3c）。在浓度梯度和时间梯度中，分数荧光与细胞质中BRD4相对表达量的关系曲线呈较好的正相关（图4g-i）。这些结果表明，JQ1-NR信号有潜力作为western blotting的替代策略，用于无创定量由JV8控制的BRD4降解含量。

图4 PROTACs介导的蛋白质降解定量验证

ESR定量体内protac介导的蛋白质降解

携带4T1肿瘤的小鼠通过腹腔注射BRD4-PROTACs (10 mg/kg)，并让其作用24小时（图5a）。为了在体内量化BRD4蛋白降解，在小鼠瘤内注射JQ1-NR (20 mg/kg)，注射后4小时进行定量成像（图5b），并切除肿瘤进行体外荧光成像（图5c）。结果显示JC2、JV4和JV8组的JQ1-NR信号显著降低，表明BRD4蛋白在这些肿瘤中降解（图5d）。通过western blotting检测这些组中的BRD4蛋白水平，验证了这一分析（图5e，f）。BRD4蛋白在JV8中完全降解，而在JC2和JV4中部分降解，这与细胞实验结果的趋势一致。分析各治疗组JQ1-NR信号与BRD4水平的关系，发现具有较好的相关性（r=0.8558，P=0.0032）（图5g）。JV8的加入显著降低了KPC胰腺癌、Hepa1-6肝细胞癌、4T1乳腺癌、CT26结直肠癌、HeLa宫颈癌等多种肿瘤模型的JQ1-NR信号。这些结果共同表明，pase标记的报告因子JQ1-NR可以通过体内荧光成像无创监测BRD4-PROTACs引发的蛋白质降解。

图5 ESR定量体内protac介导的蛋白质降解

该研究开发了一种环境敏感报告（ESR）策略，用于无创量化活细胞和体内PROTACs介导的蛋白质降解。通过加入POIs靶向配体，ESR信号激活与POIs水平表现出很强的荧光相关性。基于ESR的荧光成像为鉴定靶向降解物的POIs和早期预测PROTACs介导的治疗结果提供了方便和高通量的方法。预计ESR策略可以通过模块化设计扩展到开发用于广泛癌症相关治疗靶点的蛋白质降解物。这一策略可以为蛋白质功能研究和蛋白质降解物的开发提供见解和工具，具有非常重要的意义。

泰克生物科技（天津）有限公司建立了完善的PROTAC技术平台，致力于为全球科学家提供高质量的蛋白水解靶向嵌合体开发服务，包括方案设计、linker选择、配体选择、PROTAC合成以及下游的体外细胞验证和动物体内验证（包括动物活体成像等验证）等一站式服务，顺应时代的发展，为客户开发创新性的疾病热门靶点治疗工具，为客户的科研项目提供有力支持。

参考文献

[1] Li, T., Zong, Q., Dong, H. et al. Non-invasive in vivo monitoring of PROTAC-mediated protein degradation using an environment-sensitive reporte. Nat Commun 16, 1892 (2025).

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