令人充满希望的新型癌症治疗策略——适配体药物偶联物（ApDC）-适配体发现技术专题-泰克生物

令人充满希望的新型癌症治疗策略——适配体药物偶联物（ApDC）

适配体作为独特的靶向配体，使适配体-药物偶联物（ApDC）成为靶向癌症治疗的一种颇具吸引力的策略。Su等[1]人对一种将强效抗有丝分裂剂Monomethyl auristatin E（MMAE）与经典PTK7适配体Sgc8c偶联而成的PTK7靶向ApDC（Sgc8c-M）进行了体外的靶向性、内化作用及细胞毒性验证、在三阴性乳腺癌模型中的强大抗肿瘤效果验证。在多种PTK7过表达的癌症类型中进行的疗效研究显示，Sgc8c-M能有效诱导细胞系来源和患者来源的异种移植瘤持续消退，其效果优于未偶联的MMAE、化疗药物紫杉醇以及PTK7靶向抗体药物偶联物。Sgc8c-M在某些模型中的预临床疗效优于h6M24-vc0101，并且具有更宽的治疗窗口，这些发现突显了Sgc8c-M作为有效抗肿瘤药物的潜力，并为新兴的ApDCs的临床转化提供了有用的见解。

ApDC（Sgc8c-M）的合成与表征

为了构建ApDC Sgc8c-M，本研究采用了一步式的迈克尔加成反应，将3’-巯基修饰的适配体Sgc8c-SH与马来酰亚胺修饰的药物MC-VC-PAB-MMAE（VcMMAE）进行反应。通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）检测，证实了Sgc8c-M的成功合成和纯化（图1）。

图1 ApDC（Sgc8c-M）的结构和表征

Sgc8c-M在体外的靶向性、内化作用及细胞毒性评估

首先，本研究先做了Sgc8c-M在体外蛋白质水平和细胞水平上的靶向性。在蛋白质水平上，Sgc8c能有效地与来自小鼠、大鼠、食蟹猴和人类的PTK7重组蛋白结合，且不同物种之间的平衡解离常数（Kd）相当（图1a）。经过MMAE连接后，Sgc8c-M在不同物种中对PTK7蛋白的结合能力依然很强，其Kd值与未连接的适配体Sgc8c相似（图1b）。相比之下，Ctrl-M对人类PTK7重组蛋白没有结合作用。在细胞水平上，该适配体用Cy5染料标记，从而可以通过流式细胞术研究其与细胞的结合情况。该研究以PTK7阳性的三阴性乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-468为例进行研究，观察到Cy5-Sgc8c和Cy5-Sgc8c-M对这两种细胞的结合亲和力明显高于对照组Cy5-Ctrl和Cy5-Ctrl-M（图1c-d）。值得注意的是，Cy5-Sgc8c和Cy5-Sgc8c-M对PTK7阴性的Ramos细胞几乎没有结合作用。这些结果表明，通过MMAE连接后，Sgc8c的亲和力和特异性并未受到任何干扰。

图2 Sgc8c-M在体外蛋白质水平和细胞水平上的靶向性验证结果

随后，本研究利用流式细胞术来研究Cy5-Sgc8c-M在细胞内的内化过程及其内吞途径。该研究使用了三种经典内吞途径的抑制剂：用于巨胞饮途径的盐酸阿米洛利（AMI）、用于网格蛋白介导途径的盐酸氯丙嗪（CPZ）以及用于包膜小窝介导途径的甲基-β-环糊精（M-β-CD）。已经证实这些抑制剂对细胞无毒性（图3a）。在SUM159细胞中，Cy5-Sgc8c-M的内化受到AMI和CPZ的显著抑制，其中AMI的抑制作用更为明显（图3b）。这些结果表明，Cy5-Sgc8c-M通过巨胞饮和网格蛋白介导的内吞作用进入SUM159细胞。网格蛋白介导的内吞作用属于受体介导的内吞作用，这表明Cy5-Sgc8c-M特异性识别并结合细胞膜上的PTK7，随后通过该途径内吞进入SUM159细胞。关于巨胞饮作用，先前的研究表明其可由受体酪氨酸激酶EGFR刺激。值得注意的是，PTK7已被证明可通过EGFR/Akt信号通路促进三阴性乳腺癌的转移和进展，这表明PTK7与巨胞饮作用之间可能存在合理的联系。Sgc8c-M的内吞途径未来可通过siRNA介导的敲低或关键内吞调节因子的基因耗竭进一步验证。在MDA-MB-468细胞中，Cy5-Sgc8c-M的内化仅被巨胞饮抑制剂AMI抑制（图3c）。为了可视化内化过程，该研究进行了共聚焦显微镜观察，发现Cy5-Sgc8c-M能够迅速进入SUM159细胞的溶酶体。0.5小时后，Cy5-Sgc8c-M主要位于细胞膜上，而在2小时时，大部分Cy5-Sgc8c-M与溶酶体共定位（图3d）。最后，该研究评估了Sgc8c-M在SUM159和MDA-MB-468细胞中的细胞毒性，结果表明Sgc8c-M的毒性大于未结合的VcMMAE（图3e）。

图3 Cy5-Sgc8c-M在细胞内的内化过程及其内吞途径验证

与适配体结合后，该研究推测VcMMAE更容易与靶细胞结合并内化到溶酶体中，特定的连接分子在结合物到达靶细胞后分解，有助于MMAE的释放从而发挥细胞杀伤作用。该研究还评估了Sgc8c-M对人正常卵巢上皮细胞IOSE80和PTK7阴性癌细胞A549的细胞毒性。这些细胞的IC50值约为PTK7阳性SUM159癌细胞的6倍（补充图4），表明Sgc8c-M能够以高特异性杀伤PTK 阳性的肿瘤细胞。

图4 细胞杀伤作用验证

Sgc8c-M在三阴性乳腺癌模型中的强大抗肿瘤效果

PTK7在三阴性乳腺癌（TNBC）中高度表达，并与不良预后相关。一些研究通过研究PTK7 ADC来治疗TNBC以改善这种不良结果。为了进一步开展这些研究，该研究首先测试了Sgc8c-M在TNBC中的治疗潜力。为了验证Sgc8c-M在体内靶向的能力，该研究对携带TNBC MDA-MB-468肿瘤的小鼠进行了Cy5-Sgc8c-M的体内荧光成像（图5）。结果显示，在注射后90和120分钟，Cy5-Sgc8c-M在肿瘤部位的荧光强度明显强于Cy5-Ctrl-M（图5a）。在2小时后处死小鼠后，体外成像显示Cy5-Sgc8c-M在肿瘤中的积累量相对于Cy5-Ctrl-M显著增加（图5c）。定量荧光分析表明，Cy5-Sgc8c-M在肿瘤中的浓度是Cy5-Ctrl-M的2倍以上（P<0.05），但在两个治疗组的正常器官中未观察到显著差异（图5d）。这些发现突显了Sgc8c-M在体内的出色靶向能力，证明其在PTK7过表达的肿瘤中具有特异性富集。

图5 Sgc8c-M在体内靶向的能力验证

为了明确Sgc8c-M的靶向机制，该研究进一步通过免疫荧光成像技术在另一种三阴性乳腺癌SUM159模型中研究了Sgc8c-M与PTK7蛋白的共定位情况。Cy5-Sgc8c-M在两种细胞和异种移植肿瘤切片中均与PTK7蛋白有明显的共定位现象（图6）。这些发现提供了直接的可视化证据，表明Sgc8c-M在体外和体内均可特异性地靶向PTK7过度表达的癌细胞。

图6 在SUM159细胞及肿瘤样本中对Sgc8c-M与PTK7的共定位研究

Sgc8c-M在OVCAR3 CDX模型中相比于h6M24-vc01、紫杉醇等抗癌药物的预临床疗效

对于OVCA病种，该研究采用了OVCAR3 CDX模型，该模型具有PTK7过度表达的特征，并且常用于评估针对PTK7的ADC（抗体药物偶联物）的治疗效果，包括h6M24-vc0101和MTX-13（图7a）。72小时的细胞毒性试验结果与在HT-29和NCI-H1975细胞中观察到的结果一致，Sgc8c-M的IC50值为27.94 nM，而VcMMAE的IC50值为105.3 nM（图7b-c）。在每四天给予7?mg/kg剂量（q4d×5）和每七天给予7?mg/kg剂量（q7d×5）的Sgc8c-M治疗下，与使用紫杉醇相比，体内OVCAR3肿瘤的持续消退更为显著（图7d）。这些发现表明，在文献中观察到快速肿瘤复发的OVCA3肿瘤的治疗中，Sgc8c-M的治疗效果优于h6M24-vc0101（3mg/kg，q4d×4）。这一结果促使该研究构建了一类ADC h6M24-VcMMAE，即将h6M24-vc0101中的抗体与Sgc8c-M中相同的MMAE负载相结合，以进行进一步比较。h6M24-VcMMAE对人类PTK7蛋白的Kd值测定结果为3.18 nM（图7e），这与文献中h6M24-vc0101的结合亲和力相当。令人印象深刻的是，如图7f所示，在OVCAR3模型中，Sgc8c-M（3.5mg/kg，每4天一次，共4次）的治疗效果明显强于h6M24-VcMMAE（5mg/kg，每4天一次，共4次）。

图7 Sgc8c-M在OVCAR3 CDX模型中的预临床疗效

该研究成功开发了一种强效靶向PTK7的适配体药物偶联物（ApDC），其具有广泛的强效抗肿瘤作用和良好的安全性特征。h6M24-vc0101的临床疗效表明PTK7是一个有前景的治疗靶点。Sgc8c-M在某些模型中的预临床疗效优于h6M24-vc0101，并且具有更宽的治疗窗口。这些预临床结果表明，Sgc8c-M可能为临床环境中表达PTK7的实体瘤提供一种新的治疗选择，并有望推动基于适体的靶向癌症疗法的临床转化，以改善患者的治疗效果。

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参考文献

[1] Su, M., Liu, Y., Lin, H. et al. An aptamer-drug conjugate for promising cancer therapy with comprehensive evaluation from rodents to non-human primates. Sig Transduct Target Ther 10, 316 (2025).

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