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酵母单杂交服务

泰克生物致力于为客户提供高质量的酵母单杂交服务,为客户的已知DNA与蛋白质的互作验证、酵母单杂交文库的构建与筛选、基于酵母单杂交原理的潜在互作蛋白/新转录因子的发现和验证等下游研发工作提供有力支持。泰克生物在酵母单杂交方面拥有多年的项目开发经验和心得,能够为客户提供各种定制化的酵母单杂交服务,包括但不限于DNA与蛋白质互作验证、各类酵母单杂交cDNA文库(包括但不限于动物组织、植物组织、细胞等各类种属样本的cDNA文库)构建、靶向蛋白/潜在转录因子的筛选等各类酵母单杂交服务。

酵母单杂交(Yeast one-hybrid, Y1H)是基于顺式作用元件或启动子等DNA序列与转录因子TF互作,使得与转录因子等蛋白融合表达的GAL4的转录激活结构域(activationdomain,AD)发挥转录激活作用,激活下游基因的转录和表达的原理,将目的基因DNA序列(顺式作用元件/启动子序列)和下游的报告基因构建到同一载体上,转录因子TF或cDNA文库蛋白和AD蛋白基因构建到同一载体上,两个载体共转入同一酵母菌株,若目的基因DNA序列(顺式作用元件/启动子序列)和转录因子TF或cDNA文库蛋白相互作用,AD可激活下游基因的表达。基于这一原理,泰克生物建立了基于酵母单杂交的DNA与蛋白质互作验证平台(由于该体系为体内的互作验证,与DNA互作的蛋白空间构象更接近于天然构象,结果更加真实可靠)、酵母单杂交cDNA文库构建与筛选平台(可发现众多天然的、潜在的互作蛋白/转录因子)。泰克生物构建的酵母单杂交cDNA文库的库容可达10^6-10^7,文库多样性、插入率均可达90%以上,满足各类客户对于酵母单杂交文库的质量要求。同时,泰克生物还能提供酵母单杂交文库构建与筛选的配套的下游基因合成和亲和力测定验证等一站式技术服务,客户只需要提供具体的目的基因DNA序列信息(待研究的顺式作用元件/启动子序列)、需要构建的文库种类以及样本信息,泰克生物的科学家均能够根据客户的需求进行合理的方案设计和个性化定制,为客户的科研项目及靶向互作蛋白/新转录因子的发现助力。

 

█ 酵母单杂交服务

 

泰克生物建立了完善的酵母单杂交体系,能够提供各种高质量的定制化的酵母单杂交服务,包括但不限于各类种属样本cDNA文库构建与筛选、已知DNA与蛋白质互作验证、未知互作蛋白质/转录因子的验证及发现等,满足不同客户的科研需求。酵母单杂交文库构建服务流程如图1所示。

酵母单杂交服务-泰克生物1.jpg 

图1酵母单杂交文库构建服务流程

 

█ 服务内容和周期

 

步骤

服务内容

周期

酵母单杂交文库构建

1) 总RNA提取;

2) 高保真RT-PCR制备cDNA;

3) 载体构建与转化:载体构建(cDNA连接酵母单杂交载体:融合AD)+电击转化酵母菌株;

4) 涂板挑取阳性克隆+阳性克隆PCR扩增(跑胶鉴定)+文库NGS测序;

5) 交付:酵母文库质粒1管(>300ug),酵母文库甘油菌3-5ml,实验报告

4-6周

酵母单杂交文库筛选

1) 自激活验证;

2) 目的基因DNA(顺式作用元件或启动子)质粒与文库质粒共转酵母菌株;

3) 酵母筛选;

4) 筛选结果测序+回转验证;

5) 交付:实验报告、测序原始数据

7-9周

 

█ 服务优势

 

-- 多种种属样本可选:新鲜的动物组织样本、植物组织样本、细胞样本或各类样本的total RNA(需保证RNA不降解)等

-- 多种酵母单杂交文库可选:各类种属样本的cDNA酵母单杂交文库构建

-- 酵母单杂交技术成熟:酵母单杂交文库库容可达10^6-10^7,插入率和多样性均>90%

-- 高标准交付:酵母单杂交文库质量保证,为客户的下游实验提供有力支持

-- 实验记录可追溯:文库QC质控标准(库容、多样性、插入率),中英文实验报告,原始实验记录 

-- 可提供一系列配套的下游实验服务,文库筛选、基因合成、目的蛋白/潜在转录因子表达验证以及亲和力验证等

-- 一对一个性化方案定制,根据客户需求设计最佳的构建和筛选方案(如:文库构建方法的选择(包括但不限于SMART技术、Gateway技术等)、载体构建设计、文库筛选及自激活验证方案设计等),满足各类客户的科研项目需求

-- 一站式服务:从方案设计、RNA提取、cDNA制备、载体构建、菌株转化及筛选验证等一站式技术服务


推荐服务

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酵母单杂交服务常见问题解答

  • 筛选得到的适配体数量较少,筛选效率不高。

    优化筛选条件,包括调整筛选浓度、时间和温度等参数;增加筛选循环次数;考虑使用更敏感的检测方法,如实时荧光定量PCR或高通量测序等,以提高筛选效率。

  • 筛选得到的适配体可能出现与非目标分子的非特异性结合,导致假阳性结果。

    优化筛选条件,如增加洗涤步骤、降低非特异性结合物的亲和力阈值等;通过串联和平行筛选等策略,筛选出具有较高特异性的适配体;进行交叉验证,确认筛选结果的准确性。

  • 筛选适配体所需的周期较长,耗时耗力。

    优化筛选流程,简化步骤和操作,提高筛选的效率;采用自动化设备和高通量筛选技术,加速筛选过程;考虑并行筛选或并联筛选等策略,提高筛选的通量。

  • 筛选得到的适配体在不同条件下表现不稳定,导致筛选结果的可重复性较差。

    规范化筛选条件,确保筛选的稳定性和可重复性;优化适配体的设计和筛选方法,减少外部因素对筛选结果的影响;建立严格的质量控制流程,保证筛选结果的稳定性和一致性。

  • 目标蛋白在酵母中的表达水平较低,导致检测信号弱或无法检测到交互作用。

    优化表达载体和表达条件,如选择适当的启动子、信号序列、培养温度、时间等;使用表达辅助剂或增强剂,提高目标蛋白的表达水平;考虑使用促进蛋白稳定性的方法,如蛋白质稳定化标签。

  • 在筛选过程中出现非特异性的相互作用,干扰正常的单杂交结果。

    优化筛选条件,如调整培养基成分、添加抗生素或选择适当的筛选标记等,减少非特异性相互作用;进行质控实验,如阴性对照、阳性对照等,验证筛选结果的特异性。

  • 杂交结果需要进一步验证,确认其准确性和可靠性。

    进行多重验证实验,如重复实验、Western blot、共沉淀实验等,确保杂交结果的可重复性和准确性;进行功能性验证实验,验证相互作用的生物学意义。

  • 构建的单杂交文库中存在非特异性杂交现象,影响筛选结果的准确性。

    优化文库构建过程,包括DNA片段的选择、杂交条件的优化等,减少非特异性杂交的发生;设计合适的对照实验,用于区分特异性杂交和非特异性杂交。

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