抗体药如何生产？深度解析哺乳动物细胞培养与纯化流程

从抗击癌症的PD-1抑制剂到治疗自身免疫病的TNF-α拮抗剂，这些尖端药物逐渐家喻户晓。但是，这些结构复杂的抗体药，究竟是如何生产出来的？这些都离不开一个共同的加工厂——哺乳动物细胞。

为什么是哺乳动物细胞？

在深入流程之前，必须先回答这个问题：为什么大费周章地用哺乳动物细胞？用细菌（如大肠杆菌）不是更简单、更便宜吗？

答案在于蛋白质的“精加工”能力。许多有治疗价值的蛋白质（如抗体、激素、酶）需要经过复杂的折叠和修饰（特别是糖基化）才能具备正确的结构和生物学功能。哺乳动物细胞拥有与人类细胞相似的蛋白质加工系统，能生产出与天然人源蛋白高度相似的、安全有效的产品。而细菌系统无法完成这些复杂的修饰，生产的蛋白可能没有活性或引发免疫反应。但是对于ScFv或Fab来说，也可以利用大肠杆菌来表达：ScFv和Fab片段只包含抗体的可变区，负责抗原结合，去除了Fc段。因此它们不需要糖基化，结构相对简单，大肠杆菌这类原核系统就足以胜任其生产。

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图1

具体步骤

1. 上游工艺——细胞培养与抗体生产

我们的目标是建立一个能稳定、高效生产该蛋白的“细胞株”，

步骤1：载体构建与细胞系开发

基因克隆：

从杂交瘤细胞或通过基因测序获得目标抗体的轻链和重链基因序列。将这两个基因克隆到特定的表达载体上。

细胞转染：

将构建好的载体导入选定的哺乳动物宿主细胞中。最常用的细胞系是：

中国仓鼠卵巢细胞：工业界的金标准，它能进行正确的人源化蛋白质翻译后修饰（如糖基化），并且可以适应悬浮无血清培养。

人胚胎肾细胞：蛋白表达的速度快，且转染效率高，常用于瞬时表达。

筛选与克隆：

在培养基中加入筛选药物（如抗生素G418、杀稻瘟菌素等），只有成功转染并整合了载体（带有抗性基因）的细胞才能存活。

从存活的细胞池中，通过有限稀释法，将单个细胞分到96孔板中，确保每个孔中的细胞来自于一个单一的祖细胞，从而形成一个克隆。

细胞系构建：

从众多克隆中筛选出几个生长旺盛、抗体产量高且质量稳定的克隆。将这些优选克隆进行扩增，建立主细胞库和工作细胞库，用于长期、稳定地供应生产用细胞。

步骤2：细胞培养与扩增

这是一个逐级放大的过程，目的是获得足够数量的细胞来生产大量抗体。

步骤3：获得抗体

当细胞活力和抗体产量达到峰值后，将细胞与含有抗体的培养上清液分离开，保留上清液用于下游的的抗体提纯。

图2 瞬时和稳定蛋白质生产细胞系生成的比较时间表.png

图2 瞬时和稳定蛋白质生产细胞系生成的比较时间表

2. 下游工艺——抗体纯化与精制

步骤4——色谱方法

这是最关键的一步，利用抗体Fc区域与Protein A（来自金黄色葡萄球菌的蛋白）的特异性结合能力进行粗纯化。

经过亲和捕获后，抗体纯度已很高，但仍含有少量杂质，如宿主细胞蛋白、DNA等。通常会串联使用两种不同的色谱方法。例如离子交换色谱（依据抗体带正电、杂质带负电进行分离）、分子排阻色谱（根据分子大小进行分离）等。

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图3 亲和色谱法

步骤5——病毒去除

将纯化后的抗体溶液通过一个孔径极小的滤膜（通常为15-20纳米）。这个孔径足以让抗体分子通过，但能物理性地截留和去除任何可能存在的病毒颗粒。

这样就能得到大量具有活性的抗体了。

泰克生物科技（天津）有限公司基于噬菌体展示技术和酵母展示技术，建立了完善的靶向抗体药物发现平台，能够为全球的科学家提供高质量的包括scFv、VHH、Fab等各种类型药物单抗开发服务，并且能够开发各种功能性的结构特征抗体（包括但不限于中和抗体、构象特异性抗体、交叉反应抗体等），同时泰克生物也能够提供配套的下游抗体表达验证、抗体人源化设计与验证、抗体亲和力成熟、CAR-T候选序列设计等相关服务，满足各类客户对于药物抗体开发的需求。

参考文献

[1] Dumont J,Euwart D,Mei B, et al. Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives. Crit Rev Biotechnol. 2016;36 (6):1110-1122.

[2] Gupta K,Parasnis M,Jain R, et al. Vector-related stratagems for enhanced monoclonal antibody production in mammalian cells. Biotechnol Adv. 2019;37 (8):107415.

[3] Ecker JW,Kirchenbaum GA,Pierce SR, et al. High-Yield Expression and Purification of Recombinant Influenza Virus Proteins from Stably-Transfected Mammalian Cell Lines. Vaccines (Basel). 2020;8 (3):null.

[4] Broer LN,Knapen DG,de Groot DA, et al. Monoclonal antibody biosimilars for cancer treatment. iScience. 2024;27 (6):110115.

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