突破性酵母展示大环肽筛选平台实现高亲和力与通用性

大环肽因其高亲和力、高选择性、良好的蛋白酶稳定性和一定的膜渗透性，已成为介于小分子药物与抗体之间的理想药物形式，目前全球已有约80种肽类药物上市，其中超过40种为大环肽，且每年获批数量持续增长。但是传统的大环肽筛选技术（噬菌体展示技术、mRNA展示技术）筛选过程难以实施监控、筛选周期长、成功率低、后续合成和表征成本高。

近日，一项发表于《Nature Communications》的研究提出了一种基于酵母展示技术的高通量筛选平台，用于快速发现和表征具有高亲和力与高选择性的二硫键环化大环肽。该技术不仅克服了传统展示技术的局限性，还实现了对筛选过程的实时监控与定量分析，为肽类药物开发提供了强有力的工具。

一．技术突破-酵母展示技术+定量流式细胞技术

Sara Linciano等人将富含半胱氨酸（蓝色的C）的大环肽-linker-HA标签连接在无半胱氨酸的GPI锚定蛋白的N端（黑色线），这样做可以彻底避免大环肽中的半胱氨酸，与传统Aga1-Aga2系统形成非预期的分子间二硫键，从而保证大环肽的正确折叠和展示。他们通过改变半胱氨酸的数量或位置形成不同环大小和间隔的单环或双环库，库容量可以达到3×10? 到 2×10?之间，确保了筛选到高亲和力配体的可能性。最后结合流式细胞术，利用荧光标记抗体检测HA标签，不仅能快速定量大环肽配体的表达水平，还使结合信号与表达水平进行归一化。

图1大环肽库设计与多样性分析.png

图1大环肽库设计与多样性分析

二．多靶标筛选验证技术通用性

学者们选用了五种高度多样化的蛋白，具有无关的序列和结构。将五个酵母文库（CX7C，CX9C，CX3CX9C，CX6CX6C和CX9CX3C）合并后分别与每个PT一起孵育，首先利用链霉亲和素磁珠捕获结合肽，进行两轮磁珠初步筛选，随后进行四轮流式细胞术，进一步筛选高亲和力肽，以PT5为例经过四轮流式筛选富集率从11%提升到82%（图3 C）。最终结果显示，所有五种靶标均获得了特异性结合的大环肽，证明了该技术的广泛适用性。

图2五种不同蛋白靶点（PT）的三维结构.png

图2五种不同蛋白靶点（PT）的三维结构

图3通用筛选流程与FACS富集效果.png

图3通用筛选流程与FACS富集效果

三．亲和力和特异性验证

为确定分离出的大环肽的结合亲和力，他们用一系列已知浓度的、带有生物素“标签”的PT溶液，去处理表面展示着特定大环肽的酵母细胞，后续通过荧光检测来定量绘制结合曲线并计算出亲和力（KD值），该技术允许在酵母细胞表面快速表征选定的大环肽配体，无需化学合成和纯化。

图4酵母表面滴定法测亲和力.png

图4酵母表面滴定法测亲和力

除此之外利用表面等离子共振技术（SPR）验证了所筛选出的大环肽与PT之间的结合亲和力，结果显示多数肽的KD值在纳摩尔级别，部分达到皮摩尔级别。酵母表面滴定法是固定大环肽改变PT条件，SPR则是固定PT，这种相反方向可以排除多价结合现象导致结合亲和力被高估的可能性。

图5 SPR确定结合亲和力.png

图5 SPR确定结合亲和力

四．技术对比：酵母展示 vs 传统方法

接着，学者们比较了通过酵母展示识别的大环肽与文献中此前报道的多肽，与同一靶点之间的结合力。结果显示与噬菌体展示、mRNA展示等技术相比，酵母展示在相同或更小的库容量下，仍能筛选出更高亲和力的配体。

图6与传统技术的性能对比.png

图6与传统技术的性能对比

小结：

该研究成功开发了一种基于酵母展示的大环肽筛选平台，构建的展示库大小（~109）突破此前酵母展示文库极限，虽仍远小于mRNA显示的数量级，但与最大噬菌体显示库相当或略小。该平台可以快速高效地直接在细胞表面鉴定分离大环肽，免去昂贵且耗时的化学合成和纯化，且所有鉴定的大环肽结合亲和力均低于1 μM，虽然该研究仅证明了筛选二硫结合大环肽的能力，但酵母展示也可与其他体外导向进化工具结合，进一步发挥各自的独特优势，从而实现此前未被探索的应用。

泰克生物科技（天津）有限公司以噬菌体展示、酵母展示抗体开发服务为核心业务，同时提供配套的上下游服务如抗体测序、靶向肽的发现、亲和力成熟及测定，我们依托自主创新的核心技术平台，致力于成为全球制药企业、生物技术公司及科研机构在药物靶点识别与精准药物开发领域最值得信赖的合作伙伴。

参考文献

[1] Linciano, S., Mazzocato, Y., Romanyuk, Z. et al. Screening macrocyclic peptide libraries by yeast display allows control of selection process and affinity ranking. Nat Commun 16, 5367 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60907-x

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