双特异性抗体重组表达策略您了解多少？

近年来，双特异性抗体（bispecific antibodies, BsAbs）已成为抗体药物领域的研究热点之一。BsAbs能够同时结合两个不同靶点或同一个靶点的两个不同表位，从而发挥传统单抗无法实现的生物学功能，例如，BsAbs将免疫细胞与肿瘤细胞桥接或实现双重信号通路阻断等。BsAbs的“双特异性”使其在癌症治疗方面发挥更好的治疗优势，但是其生产工艺却很复杂，主要体现在“链配对”问题上，本期主要围绕BsAbs的“链配对”设计优化、表达效率优化及纯化技术优化进行分享。

1. BsAbs重组表达核心问题：“链配对”

BsAbs重组表达的核心技术挑战，在于链配对的精准控制。经典的IgG四链BsAbs由两条不同的重链（HC）和两条不同的轻链（LC）组成。当这些基因共同转染进宿主细胞（如CHO或HEK293细胞）时，理论上会产生多达10种不同的IgG组合，而其中只有一种是目标双抗。轻链与重链的随机错配以及重链间的同源二聚化，会导致目标产物的组装率极低（传统方法下可能只有约25%），并产生大量难以分离的副产物，极大增加了下游纯化的难度和成本。

2. BsAbs重组表达优化策略：

(1) 重链配对“Knobs-into-Holes”策略：

Knobs-into-Holes是解决重链错配最经典的技术之一。通过在两个不同的重链Fc区分别引入空间上互补的“杵”（knob）和“臼”（hole）突变，利用空间位阻效应迫使两条不同重链优先配对形成异二聚体，而非同源二聚体。这一技术有效提高了目标BsAbs的组装效率。

图1 Knobs-into-Holes设计原理图

(2) 轻链配对：“Common Light Chain”策略

轻链错配的挑战更为棘手，因为轻链与重链可变区的配对具有高度特异性。Common Light Chain提供了一个解决方案：通过基因工程改造抗体转基因小鼠或设计分子，使所有候选抗体共用一条相同的轻链。这样，只需筛选针对两个不同靶点的特异性重链，再将其与固定轻链组合，即可保证正确的轻重链配对，从源头上杜绝了轻链错配问题。平台数据显示，该策略可将BsAbs正确组装率从传统方法的约25%提升至95%以上，显著缩短研发周期。

(3) 单载体双向启动子系统：表达效率的优化

除了分子设计层面的改造，表达载体本身也有优化空间。最新研究报道了一种采用双向CMV启动子的单载体系统（peaSKY）。与传统双载体共转染相比，该系统通过消除冗余骨架序列，使表达盒占比提高17%，并实现了重链和轻链的同步转录，从而更有利于蛋白的正确折叠和组装。在瞬时表达中，该系统的BsAbs产量比双载体系统提高了2倍。

(4) 纯化技术的革新：耐碱型Protein L

即使工程化改造提升了目标产物的比例，高效纯化仍是决定生产可行性的关键。Wakabayashi和Kuramochi重点介绍了亲和层析技术的新进展，特别是耐碱型Protein L填料的开发。Protein L能够结合抗体轻链的κ可变区，对于纯化缺乏Fc区的片段型双抗或作为Protein A亲和层析的补充手段，具有独特优势。耐碱的特性使得填料可进行原位清洗（CIP），大大提升了工艺的经济性和便捷性。

3. 小结：

BsAbs重组表达设计策略，无论是“Knobs-into-Holes”还是“Common Light Chain”平台，无论是优化表达载体还是引入新型层析介质，每一步都指向同一个目标——在复杂的链配对中，找到通往高纯度、高产量、高质量制药产品的路径。与此同时，抗体基因工程技术持续发展，提供了多种可能性，使复杂分子的高效表达以及将新型功能引入抗体成为现实。

泰克生物科技（天津）有限公司在双特异性抗体开发方面具有多年的项目经验和心得，基于噬菌体展示技术和酵母展示技术搭建了完善的抗体药物前期发现平台。针对不同的项目需求，泰克生物能够定制化设计合理的双特异性抗体结构和表达纯化策略，同时借助成熟的哺乳表达发酵平台生产高质量的双特异性抗体产品，满足客户的不同需求。

参考文献：

[1] Carter, P. J., & Rajpal, A. (2022). Designing antibodies as therapeutics. Cell, 185(15), 2789–2805.

[2] Brinkmann, U., & Kontermann, R. E. (2017). The making of bispecific antibodies. mAbs, 9(2), 182–212.

[3] Wakabayashi, T., & Kuramochi, T. (2025). Discovery and development of bispecific antibodies. Protein Expression and Purification, Volume 236, 2025,106787, ISSN 1046-5928.

[4] Merchant, A., Zhu, Z., Yuan, J. et al. An efficient route to human bispecific IgG. Nat Biotechnol 16, 677–681 (1998).

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