膜系统酵母双杂交：膜蛋白互作验证的完整方案-酵母展示技术专题-泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家

膜系统酵母双杂交：膜蛋白互作验证的完整方案

传统酵母双杂交系统的各种改良方法在检测或验证细胞核与胞质蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用方面发挥了重要作用。这些方法不仅有助于发现新的相互作用伙伴，还为它们的功能提供了线索。然而，由于膜蛋白（如受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体、膜结合磷酸酶和转运蛋白）具有疏水性，难以通过传统的蛋白质相互作用分析手段对膜蛋白互作进行研究。因此，一种能够识别内嵌膜蛋白遗传系统的“基于split-ubiquitin系统的酵母双杂交（即膜系统酵母双杂交）检测”方法解决了这个难题，该方法将泛素的两个半段与至少其中一个为膜蛋白的两个相互作用蛋白融合。当这两种膜蛋白互作时，泛素的两半部分会结合在一起，而与目标膜蛋白融合的转录因子则被切割并释放。游离的转录因子随后进入细胞核，激活报告基因的转录。

图1 膜系统酵母双杂交原理图

一、为什么核系统双杂做不了膜蛋白

在酵母双杂交系统中，诱饵蛋白融合DNA结合域（BD），猎物融合转录激活域（AD），两者在核内相遇，凑出一个有功能的转录因子，激活报告基因，所有检测都必须在细胞核内进行。若通过酵母双杂交方法评估膜蛋白互作，必须将膜蛋白切分成片段，然后重新定位到细胞核中。然而部分膜蛋白无法在细胞核环境中有效表达、并且由于膜蛋白具有疏水性，难以进行生化分析，这使得蛋白质的分离变得困难，从而增加了测定膜蛋白互作的复杂性。因此，尽管膜关联蛋白约占生物体蛋白质总量的三分之一，但对膜蛋白以及膜蛋白互作的研究仍十分有限。

这不是优化实验条件能解决的，是系统原理层面的不兼容。膜蛋白互作需要一套根本不要求蛋白进核的检测逻辑。

二、split-ubiquitin系统原理与载体组成

split-ubiquitin系统怎么用？泛素是一个76个氨基酸的小蛋白，被泛素特异性蛋白酶（UBPs）识别后切割。把泛素拆成两半：C端半分子（Cub）融合在诱饵膜蛋白的胞质侧，后面接一个转录因子；N端半分子（NubG）融合在猎物蛋白上。NubG带有一个关键突变（I13G），使其不能自发与Cub重组。当诱饵和猎物发生互作时，Cub和NubG被拉近，重构出完整的泛素折叠。胞内的UBPs识别这个重构的泛素，在Cub末端切割，把LexA-VP16释放出来。游离的转录因子进入细胞核，激活报告基因。整个过程中，诱饵蛋白始终锚定在膜上，猎物也不需要进核。

载体组成：诱饵载体将目的蛋白插入在Ost4p膜锚定序列与Cub-LexA-VP16之间，Ost4p把整个融合体固定在内质网膜上，保证拓扑正确。猎物载体表达NubG融合蛋白，用于构建cDNA文库或单基因验证。报告菌株NMY51基因组整合了受LexA调控的HIS3、ADE2和lacZ，三重筛选压低假阳性。Snider等在Nature Protocols上给出的完整膜系统酵母双杂原理与流程显示，从诱饵构建、验证到文库筛选，整个周期通常四到六周。

图2 目标诱饵蛋白筛选膜系统酵母双杂交猎物cDNA文库的典型流程图

三、诱饵蛋白自激活检测与毒性评估

自激活检测：在膜系统酵母双杂交里，诱饵-Cub-LexA-VP16融合蛋白如果自身构象让UBPs非特异性切割，或者LexA-VP16部分被意外释放，同样会出现不用猎物也能长的克隆。标准操作是：诱饵质粒单独转化NMY51，涂SD-Leu平板，挑单克隆测OD，然后点板到SD-Leu-His（加或不加3-AT）上。如果诱饵单独就能在缺His板上生长，说明存在自激活，需要提高3-AT浓度或换用弱启动子载体。

毒性评估：膜蛋白过表达容易压垮酵母的分泌系统，尤其是多次跨膜蛋白。诱饵转化后，比较其与空载体对照在SD-Leu液体培养基中的生长曲线。如果诱饵组对数期明显滞后或终OD低50%以上，后续筛库的阳性率会大打折扣，建议降低培养温度至25℃或换用低拷贝载体。

四、与Co-IP的适用场景对比

膜蛋白互作验证方法对比：

(1) 膜系统酵母双杂交：的核心优势是发现未知互作。它不需要事先知道互作蛋白是谁，可以用cDNA文库做无偏筛选。

(2) Co-IP：内源互作的标杆，其逻辑是在真实细胞里、接近生理表达水平下、看两个蛋白是否互作。但Co-IP需要好抗体（IP级别抗体），裂解条件要温和到能保留互作又不至于把膜蛋白从膜上剥下来，而且无法区分直接互作和桥接互作。

膜系统双杂最经典的用法是通过膜系统酵母双杂交筛到的候选互作蛋白，再交给CO-IP方法进行确认。

小结：

膜系统酵母双杂交解决了核系统做不了膜蛋白互作的根本问题。为了更好的确认两个膜体系蛋白的互作，需要多种检测方法相结合，即通过split-ubiquitin筛出候选互作蛋白序列，再通过Co-IP在更接近生理的体系中进行确认，这样会让我们的验证结果更具有说服力。

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参考文献：

[1] Iyer K, Bürkle L, Auerbach D, et al. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Science’s STKE, 2005, 2005(275): pl3.

[2] Snider J, Kittanakom S, Damjanovic D, et al. Detecting interactions with membrane proteins using a membrane two-hybrid assay in yeast. Nature Protocols, 2010, 5(7): 1281–1293.

[3] Fetchko M, Stagljar I. Application of the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to investigate membrane protein interactions. Methods, 2004, 32(4): 349–362.

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