单B细胞技术如何革新抗体发现-抗体改造与修饰专题-泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家

单B细胞技术如何革新抗体发现

四十多年来，抗原特异性 B 细胞的筛选一直是生物治疗药物开发的关键。上一篇简单介绍了Super SingleB^?的原理，即通过采集免疫后个体的外周血单核细胞，利用流式细胞术或微流控技术的到特定B细胞，随后进行PCR扩增出抗体基因，通过体外表达来获得单克隆抗体。那么具体是如何实现从细胞到抗体呢？

Super SingleB^?的关键是：B细胞受体（每个B细胞表面都有独特的膜结合形式的抗体），单细胞测序和克隆技术（能够从单个细胞中扩增出微量且完整的抗体轻链和重链可变区基因），抗原特异性标记（使用带有荧光标记的重组抗原作为“探针”，来识别和分离那些能够结合目标抗原的B细胞）。

1.B细胞的分离和富集

采集免疫后个体的外周血单核细胞（PBMCs），使用磁珠分选技术从PBMCs中富集总B细胞群体。

2. 抗原特异性B细胞的鉴定与单细胞分选

首先将目标抗原与荧光素进行标记制成探针，随后将荧光探针与富集的B细胞孵育，同时使用针对B细胞表面标志物的荧光抗体进行染色，进一步排除干扰（CD19或CD20是泛B细胞标志、CD3可以排除T细胞、CD27标记记忆B细胞、IgG/IgA/IgM能够区分抗体亚型）。

标记好的B细胞通过流式细胞仪，根据抗原探针阳性以及B细胞标志物阳性，设定分选门路，将单个目标B细胞直接分选到96孔PCR板的每个孔中，孔内已预先加有细胞裂解液和RNA酶抑制剂。

或者使用微流控技术，是另一种高通量方法，利用微流控芯片操纵纳升级别液滴，实现单细胞的捕获和后续操作。

3. 抗体基因的克隆与体外表达

现在得到了单B细胞，可以通过巢式PCR两次扩增获得抗体的可变区基因片段，记得要通过通过电泳检查PCR产物的大小是否正确，以确认成功扩增出VH和VL基因。

将纯化后的VH和VL 的PCR产物分别克隆到重/轻链抗体表达载体中（含有抗体恒定区）。将重链和轻链的表达质粒按一定比例共同转染至哺乳动物表达系统（如人胚肾细胞HEK293F、中国仓鼠卵巢细胞ExpiCHO），因为这些系统能进行正确的蛋白质折叠和翻译后修饰（如糖基化），产生有功能的完整抗体。细胞培养数天后，从上清液中收获表达的抗体。可以通过Protein A/G或anti-human IgG抗体进行纯化，得到高纯度的重组单克隆抗体。

4. 验证

利用ELISA、表面等离子共振等方式验证亲和力。通过中和实验评估抗体阻断病毒进入细胞的能力等等。

总的来说，传统杂交瘤技术是以获得一个能分泌特定抗体的单一、稳定的细胞系为目的，它的筛选逻辑是“找到即可”，并且杂交瘤可能丢失染色体，导致抗体表达不稳定。而单B细胞筛选技术最后获得的是抗体基因，基因序列稳定，可永久保存需通过重组表达生产抗体。通过分选技术（流式或者微流控技术），可以得到一个针对抗原的多样性抗体库（可能是结合同一个抗原不同的表位的抗体），得到数百至数千个单克隆抗体，然后从中选择最优的。

泰克生物科技（天津）有限公司建立了完善的单B细胞抗体发现平台，致力于为全球科学家提供高质量的单B细胞抗体开发服务，该平台能够高效、快速地获得全人源抗体。我们提供一站式服务方案，为客户的科研项目及针对难治性疾病靶点的下一代治疗性抗体开发提供有力支持。

参考文献

[1] Pedrioli A,Oxenius A. Single B cell technologies for monoclonal antibody discovery. Trends Immunol. 2021;42 (12):1143-1158.

[2] Acar DD,Witkowski W,Wejda M, et al. Integrating artificial intelligence-based epitope prediction in a SARS-CoV-2 antibody discovery pipeline: caution is warranted. EBioMedicine. 2024;100:104960.

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