用于治疗疾病的单克隆抗体开发-抗体改造与修饰专题-泰克生物—酵母与噬菌体展示CRO，纳米抗体与抗体药物开发专家

用于治疗疾病的单克隆抗体开发

自1986年美国食品和药物管理局（FDA）批准第一种单克隆抗体以来，已经过去了三十多年，在此期间，抗体工程发生了巨大的发展。目前的抗体药物由于其高特异性，不良反应越来越少。因此，治疗性抗体已成为近年来开发的新药的主要类别。在过去的五年里，抗体已经成为制药市场上最畅销的药物，全球治疗性单克隆抗体市场价值逐年增长。因此，随着新药被批准用于治疗各种人类疾病，包括许多癌症、自身免疫性疾病、代谢和传染病，治疗性抗体药物的市场经历了爆炸式增长。截至2019年12月，已有79种治疗性单克隆抗体获得美国FDA批准，但仍有显着的增长潜力。目前用于治疗性抗体药物开发的卓越抗体工程技术包括单克隆抗体人源化、噬菌体展示、人抗体小鼠、单B细胞抗体技术和亲和成熟技术等。这些发展，加上对抗体免疫调节特性的更深入了解，为治疗人类疾病的下一代新的和改进的基于抗体的药物开发铺平了道路。

治疗性抗体开发数据和发展历程

在全球范围内，商业公司至少有570种治疗性单克隆抗体在临床试验中进行了研究，79种治疗性单克隆抗体已获得美国食品和药物管理局（US FDA）的批准，目前正在上市，其中30种单克隆抗体用于治疗癌症。治疗性单克隆抗体的重要性日益增加是显而易见的，因为单克隆抗体在过去25年中已成为各种疾病的主要治疗方式。在此期间，重大的技术进步使单克隆抗体疗法的发现和开发更快、更有效。

首个治疗性单抗是muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3)，于1986年获得美国FDA批准，包含一种针对T细胞表达CD3的小鼠单抗（图1A），可作为免疫抑制剂治疗急性移植排斥反应，为了克服免疫原性潜力和疗效下降的问题，使抗体的治疗使用时间延长，研究人员开发了一种技术，将啮齿动物抗体转化为更类似于人类抗体的结构，同时又不失去结合特性，首个嵌合抗体（abciximab）于1994年获得美国FDA批准，用于抑制心血管疾病中的血小板聚集。该药物是通过将小鼠可变区域序列与人类恒定区域序列结合而开发的（图2B）。通过互补决定区（CDR）嫁接技术产生人源化抗体是加速治疗性单克隆抗体批准的一个特殊进展。在CDR嫁接中，将非人抗体CDR序列移植到人框架序列中，以保持靶特异性（图2C）。抗体的人源化使临床应用一类新的生物制剂成为可能，这些生物制剂直接针对癌症和自身免疫性疾病等需要长期治疗的疾病。

图1 各类抗体的结构示意图

抗体开发技术

1.噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是目前应用最广泛的体外抗体选择技术。该技术利用重组DNA技术将外源肽与噬菌体M13的外壳蛋白（pIII）融合，以便在噬菌体表面展示肽，后来发现，像scFv、VHH等小分子量抗体可以在噬菌体上表达，因此建立了不同的M13噬菌体展示抗体库。抗体文库通常通过迭代筛选以富集目标结合噬菌体，然后在大肠杆菌细胞中扩增结合的噬菌体（图2）。

图2 噬菌体文库筛选流程图

2.转基因动物和抗体人源化技术

转基因动物是获得完全人单克隆抗体的另一种技术（图3）。对这些细胞系进行基因修饰，将人免疫球蛋白（Ig）基因插入基因组，取代内源性Ig基因，使这些动物在免疫后能够合成完全的人抗体。根据免疫方案的不同，通过进一步选择免疫转基因小鼠产生的杂杂瘤克隆，可以获得高亲和力的人源抗体。转基因动物为抗体药物的开发提供了可靠的平台。与其他生产人抗体的技术相比，转基因动物具有不需要人源化、更具多样性、体内亲和成熟和克隆选择抗体优化等优点。

图3 转基因动物制备人源抗体原理流程图

3. 嵌合抗体技术

为了克服全人源重链抗体的缺陷，有必要保留原鼠的恒定区。将人类VH、D和JH基因与大鼠恒定区位点联系起来。利用细菌人工染色体（BAC）和YAC技术对人IgL和IgH的大片段进行亚克隆和连接，并将小位点质粒微注射到受精卵母细胞中。同时，用锌指核酸酶使内源性大鼠Ig基因座沉默。由此产生的大鼠株（OmniRat）嵌合人表现出与野生型大鼠相似的抗体产生、抗原亲和力和体细胞突变。

4.单B细胞抗体技术

在人体免疫系统中，抗体反应是稳健、高度特异性、中和和自我耐受的。使用传统的杂交瘤技术或转基因小鼠生产治疗性人抗体需要长期的免疫程序和筛选，而临床使用小鼠抗体可能引发严重的免疫原性反应。为了避免这些障碍，研究人员开发了一种利用EB病毒使人类B细胞永生的技术。在传染病等紧急情况下，单B细胞抗体技术的主要优势在于只需要少量细胞，从而可以高效、快速地分离潜在的单克隆抗体。此外，单个B细胞克隆保留了生物介导的重链和轻链配对，而不是噬菌体展示抗体库中单克隆抗体的随机配对。这些随机配对的单克隆抗体偶尔会在从scFv转移到完整的IgG格式时失去结合亲和力或产生自反应性。单个B细胞分选后，直接克隆每条Ig重链和相应的轻链，然后克隆这些基因并在哺乳动物细胞系中表达，以便立即产生重组单克隆抗体（图4），在检测单抗反应性后，确定每个生成的单抗的特征。

图4 单B细胞技术制备人源抗体原理流程图

治疗性抗体大致可分为两大类（图5）。第一类涉及直接使用裸抗体进行疾病治疗。这类抗体用于癌症治疗，并通过不同的机制引发细胞死亡，包括ADCC/CDC，直接靶向癌细胞诱导凋亡，靶向肿瘤微环境，或靶向免疫检查点。对于第二类抗体，需要进行额外的工程处理以提高其治疗效果。使用这些抗体的一些一般方法包括免疫细胞因子、抗体-药物偶联物（ADC）、抗体-放射性核素偶联物（ARC）、双特异性抗体、免疫脂质体和CAR-T。

图5 各类治疗性抗体作用原理图

本文总结了与生产治疗性抗体相关的五种技术平台，包括嵌合抗体、人源化、噬菌体展示、转基因小鼠和单B细胞抗体技术。噬菌体展示、转基因小鼠和单B细胞抗体技术已被证明是产生人类抗体的可靠方法。高质量（抗体多样性）的噬菌体抗体文库是成功鉴定治疗性单克隆抗体的关键。此外，噬菌体展示文库的最佳筛选取决于靶抗原质量、抗原固定化、结合和洗涤条件的严格控制。此外，可以通过筛选方案设计定制从生物筛选中发现的抗体的特征，包括构象特异性、表位特异性、内化、中和和种间交叉反应性。

泰克生物科技（天津）有限公司基于噬菌体展示技术和酵母展示技术，建立了完善的靶向抗体药物发现平台，能够为全球的科学家提供高质量的包括scFv、VHH、Fab等各种类型药物单抗开发服务，并且能够开发各种功能性的结构特征抗体（包括但不限于中和抗体、构象特异性抗体、交叉反应抗体等），同时泰克生物也能够提供配套的下游抗体表达验证、抗体人源化设计与验证、抗体亲和力成熟、CAR-T候选序列设计等相关服务，满足各类客户对于药物抗体开发的需求。

参考文献

[1] Lu, RM., Hwang, YC., Liu, IJ. et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci 27, 1 (2020).

上一篇:重组蛋白原核表达常见问题及解决方案下一篇:无!