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酵母单杂交常见问题

一、酵母单杂实验原理

 

酵母单杂交技术是由酵母双杂交GAL4系统衍生而来,可以实现在酵母细胞内分析与鉴定转录因子是否与DNA顺式作用元件相互结合以及验证互作位点。简单来说,将一段已知特定序列的顺式元件构建到最基本启动子(minimal promoter, Pmin)的上游,在Pmin下游连接报告基因,构成包含target DNA Element(bait sequence)的诱饵DNA。将转录因子构建到可以表达AD激活结构域的载体上,表达形成融合猎物蛋白(prey)。如果转录因子和顺式作用元件存在相互作用,便会激活Pmin,从而促使报告基因得到表达。因此,可以通过检测报告基因表达与否来判断顺式作用元件与转录因子是否发生互作。

酵母单杂原理图-泰克生物.png 

酵母单杂原理图

 

二、酵母单杂常见系统

 

常用的酵母单杂系统有Y1Hgold(pABAi+pGADT7 / pGADT7-REC),Y18(pHis2+pGADT7 / pGADT7-REC),EGY48(pLacZi+pB42AD)。三种单杂体系未发现有明显的优劣之分。三者的区别如下:

1)pAbAi-Bait(DNA)+pGADT7rec或者pGADT7;Y1HGold菌株。插入目的DNA的pAbAi载体需要线性化后转到Y1HGold菌株,制成Bait菌株;筛选标记AbA;

2)pHIS2-Bait(DNA)+pGADT7;Y187菌株。Bait不需要整合到酵母基因组,不需要线性化;筛选标记His+3-AT。

3)pLacZi-Bait(DNA)+pB42AD;EGY48菌株。Bait载体需要线性化整合到酵母基因组;筛选标记X-gal。

 

三、酵母单杂实验流程(以Y1HGold为例)

 

1)载体:

酵母单杂-泰克生物1.png 

 

 

pGADT7 (连接转录因子)

酵母单杂-泰克生物2.png 

 pGAbAi(连接启动子)

2)宿主:Y1HGold

3)培养基:SD/-Ura、SD/-Ura+不同浓度AbA、SD/-Ura/-Leu+AbA

4)实验步骤:

1) 将转录因子构建至pGADT7载体命名为AD-prey,将启动子构建至载体pGAbAi命名为AbAi-bait

2) 将构建好的AbAi-bait质粒进行BstbI酶切线性化,以便整合到酵母染色体上,随后后转入Y1HGold感受态细胞中,涂布至SD/-Ura营养缺陷型固体培养基,28℃培养2-3天,挑取阳性克隆并进行PCR鉴定。

3) 将(2)中鉴定的阳性克隆培养至OD值为0.2后点至含有不同浓度(0 -1000 ng/mL)AbA的SD/-Ura平板上,再以十倍为梯度稀释3个浓度,以菌液OD为0.002的为标准,筛选出可以抑制酵母菌落生长的浓度,即为抑制其自激活的AbA浓度。

4) 将(2)中得到的阳性克隆制备成感受态细胞

5) 将空载pGADT7(对照)和构建好的AD-prey(实验)质粒分别转入(4)中制备的感受态细胞,并涂布至SD/-Ura/-Leu+AbA(AbA浓度为(3)中抑制启动子自激活的浓度)固体培养基上

6) 观察菌落在28℃培养条件下的生长情况,如果对照组不生长而实验组生长,则说明转录因子与启动子之间存在相互作用。

四、酵母单杂应用举例

酵母单杂主要应用于DNA和蛋白质(多为转录因子)的相互作用研究方面:

①鉴定DNA-蛋白质之间是否存在相互作用

②筛选结合于顺式作用元件上的新基因

③验证已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

 

a Promoter structure of the SLR1 gene. Red dots indicate the W-boxes. W1,2 and W3 indicate the tested regions. b Yeast one-hybrid assays showing OsWRKY36 binding to the promoter of SLR1. Empty pPB42AD was used as negative control. SLR1-1 contains W1,2 and SLR1-2 contains W3 as indicated in fgure a.

Jie Lan等人利用酵母单杂,对水稻的SLR1启动子的W-box进行截取,验证了WRKY36基因与SLR1基因的结合位点。

酵母单杂-泰克生物3.jpeg 

The direct binding of AmMYB24 to MYBCOREATCYCB1 checked by Y1H

AmMYB24 Regulates Floral Terpenoid Biosynthesis Induced by Blue Light in Snapdragon Flowers这篇文章中作者利用酵母单杂验证了金鱼草MYB24转录因子与OCS启动子的结合位点。

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