新型癌症治疗手段--双特异性抗体药物偶联物（BsADC）开发-抗体改造与修饰专题-泰克生物

新型癌症治疗手段--双特异性抗体药物偶联物（BsADC）开发

结直肠癌是一种发生在结肠或直肠的恶性肿瘤，每年新增病例约15万例。目前的治疗策略，如手术、化疗、放疗和免疫疗法，都面临着诸如癌症复发、药物耐药性以及显著毒性等挑战。因此，这些患者迫切需要更有效的治疗方法。铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的新型细胞死亡形式，作为一种治疗结直肠癌的有前景的新方法而崭露头角。通过抑制磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）或半胱氨酸/谷氨酸载体SLC7A11，会导致细胞内谷胱甘肽（GSH）的耗竭，从而引发脂质过氧化和随后的铁死亡。在此，Zhang等[1]人发现CDH17和GUCY2C在结直肠癌细胞中共过表达，并开发了一种靶向CDH17和GUCY2C的双特异性抗体药物偶联物（BsADC），并与铁死亡诱导剂RSL3（一种GPX4抑制剂）结合。实验结果表明，与单克隆抗体ADC相比，BsADC具有更好的结合和内化活性，并且能够更有效地抑制肿瘤细胞的增殖。这些发现表明，能够诱导肿瘤细胞发生铁死亡的CDH17-GUCY2C BsADC可能是一种治疗结直肠癌的有前景的新方法，也为未来难治性肿瘤疾病的靶向药物开发提供了新思路。

该研究对基因表达分析与交互分析（GEPIA）数据库进行了全面分析，以确定可能适合作为开发基于CDH17的双特异性抗体药物偶联物（BsADCs）的肿瘤相关靶点的抗原，这些抗原还应在结直肠癌中高度表达。在33种人类癌症类型中，GUCY2C表达模式与CDH17相似（图1A），CDH17和GUCY2C在大多数结直肠癌患者和直肠腺癌患者中呈共同高表达。该研究进一步在GEPIA数据库中分析了CDH17和GUCY2C的表达情况。如图1B所示，CDH17和GUCY2C在结直肠癌中均高度表达。该研究还通过RT-PCR检测了13种肿瘤细胞系中CDH17和GUCY2C的表达情况，并发现CDH17和GUCY2C在各种肿瘤细胞中具有明显的共表达（图1C）。这些结果表明，CDH17和GUCY2C在结直肠肿瘤细胞中的表达水平之间存在很强的相关性，为针对CDH17和GUCY2C的BsADCs的构建提供了支持。

图1 CDH17和GUCY2C在结直肠肿瘤细胞中的表达水平相关性验证结果

该研究利用来自两款临床产品（BI-905711和PF07062119）的CDH17和GUCY2C抗体序列构建了BsAbs。为了获得具有高结合能力和内化能力的BsAb，共构建了六种不同结构的双特异性抗体（图2A）。BsAb1和BsAb2采用“2+2”四价结构，其中一种单克隆抗体的C端与另一种抗体的scFv形式相连。BsAb3和BsAb4采用“1+1”二价结构。BsAb5和BsAb6也采用四价结构，不同之处在于两种抗体的可变区序列位于N端。该研究检测了这六种CDH17和GUCY2C的BsAb在SW1463和LS1034癌细胞中的结合和内化能力。如图2B所示，BsAb1在这两种细胞中的结合能力均优于其父本单克隆抗体。同时CDH17 单克隆抗体的结合活性优于GUCY2C单克隆抗体，这可能是由于肿瘤细胞上CDH17的表达水平高于GUCY2C。然而，CDH17单克隆抗体的内吞活性远低于GUCY2C单克隆抗体，这可能会降低CDH17单克隆抗体ADC的抗肿瘤活性。但当与GUCY2C结合形成BsAbs时，几种双特异性结构显示内吞活性提高，其中BsAa1的内吞活性最好（图2C）。这些数据表明，具有“2+2”四价结构的BsAb1能够增强对肿瘤细胞的结合和内化活性，这适合用于构建BsADC。

图2 CDH17和GUCY2C双抗的开发与特性研究

RSL3被证实为铁死亡的激活剂，其作用机制是通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）。通过将RSL3-NH2负载物与BsAbs中的内源性半胱氨酸残基进行生物共轭，从而生成了CDH17和GUCY2C双特异性抗体偶联药物（BsADCs）。疏水相互作用色谱显示药物分布均匀，合成的ADC的药物偶联度（DAR）约为4（图3B）。该研究进行了BsADCs在SW1463和LS1034细胞中的细胞毒性作用实验，这些细胞高度表达CDH17和GUCY2C。研究发现BsADCs对肿瘤细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，且这种活性显著高于分别针对CDH17和GUCY2C的单特异性ADC（在SW1463中，IC50为4.97 μg/mL对比27.72 μg/mL和11.59 μg/mL；在LS1034中，IC50为2.249 μg/mL对比39.15 μg/mL和10.02 μg/mL）（图3C）。相比之下，含有相同连接子和有效载荷的抗体药物偶联物（IgG-ADC）并未表现出细胞生长抑制活性（图3C）。这些结果表明，BsADC能够特异性地抑制CDH17和GUCY2C高表达的肿瘤细胞。与传统的免疫肿瘤疗法相比，抗体药物偶联物（ADCs）的一个显著优势在于它们能够诱导旁观者杀伤效应。为了测试CDH17和GUCY2C BsADC是否具有旁观者细胞毒性作用，该研究评估了CDH17和GUCY2C BsADC在与CDH17/GUCY2C阳性细胞（LS1034、SW1463）混合72小时后，对CDH17/GUCY2C阴性细胞（HT-29）诱导的旁观者细胞毒性能力。如图3D所示，当SW1463或LS1034细胞与HT-29细胞共培养时，SW1463或LS1034细胞的杀伤量并未增加，但与对照组相比，与SW1463/HT-29或LS1034/HT-29共培养增加了CDH17/GUCY2C阴性HT-29细胞的旁观者杀伤作用。相比之下，SW1463/HT-29或LS1034/HT-29在与IgG1-ADC共孵育72小时后，其细胞毒性并未出现显著变化（图3E）。

图3 CDH17和GUCY2C双特异性抗体体外抗肿瘤效果验证

随后，该项目研究了BsADC是否通过铁死亡诱导细胞死亡。将SW1463和LS1034细胞分别用5 μg/mL的hIgG1-ADC、CDH17-ADC、GUCY2C-ADC和BsADC处理24小时，然后评估相关的铁死亡标志物。铁死亡通常伴随着细胞内丙二醛（MDA）的积累。通过检测细胞样本中的MDA水平发现，与用hIgG1-ADC、CDH17-ADC和GUCY2C-ADC处理的细胞相比，用BsADC处理的细胞MDA水平显著升高（图4A）。此外，通过使用BODIPY-C11染色来观察细胞样本中活性氧（ROS）的变化，进一步研究了脂质过氧化水平的变化。如图4B所示，肿瘤细胞在BsADC处理后脂质过氧化产物显著增加，且显著高于用CDH17-ADC或GUCY2C-ADC处理的细胞。综上所述，这些结果表明BsADC通过将RSL3运输到肿瘤细胞中诱导铁死亡。

图4 CDH17和GUCY2C融合形成的BsADC诱导结肠癌细胞发生铁死亡

该研究开发了一种CDH17和GUCY2C双特异性抗体药物偶联物（BsADC），CDH17和GUCY2C在正常组织中表达水平较低，而BsADC也不会增加对正常组织的结合和内化，从而避免了毒性。目前，BsADC已进入临床阶段，并取得了良好的治疗效果。人们希望在未来，BsADC也将为更多结肠癌患者带来新的治疗方法。

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参考文献

[1] Zhang, Y., Du, J., Cui, X. et al. Development of a bispecific CDH17-GUCY2C ADC bearing the ferroptosis inducer RSL3 for the treatment of colorectal cancer. Cell Death Discov. 11, 347 (2025).

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