免疫CAR细胞制备技术服务-泰克生物-酵母展示服务专家

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免疫CAR细胞制备技术服务

泰克生物是由一群深耕于抗体药物发现方面的专家组成的团队，平均项目经验超过10年，建立了完善的基于噬菌体表面展示技术平台的抗体药物候选分子发现平台，能够为客户提供一系列跟治疗性生物大分子发现相关的服务，包括但不限于VHH抗体、scFv抗体和Fab抗体发现，CAR-T先导抗体序列设计，CAR-NK先导抗体序列设计等服务。经过10年左右的发展，泰克生物在抗体噬菌体展示技术平台的基础上，又成功搭建了酵母表面展示技术的抗体发现平台，能够更加快速的为客户提供高质量抗体先导序列的发现以及下游配套的开发服务。

█ 免疫治疗性CAR开发技术服务

CAR-T疗法是指嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy（CAR-NK类似，只是将T细胞更换成NK细胞）。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。

T细胞也叫T淋巴细胞，是人体白细胞的一种，来源于骨髓造血干细胞，在胸腺中成熟，然后移居到人体血液、淋巴和周围组织器官，发挥免疫功能。技术人员通过基因工程技术，将VHH抗体基因，scFv抗体基因通过合适的方法，如慢病毒包装方式转入到T细胞中，通过VHH或scFv的膜定位表达，即给T或NK细胞定制了一套特殊的针对特异性肿瘤的定位导航装置CAR（肿瘤嵌合抗原受体），即CAR-T细胞，利用其“定位导航装置”CAR，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，从而高效地杀灭肿瘤细胞，达到治疗恶性肿瘤的目的。

相比于传统scFv抗体（来自普通的IgG抗体），来自驼源动物的VHH抗体（又称为重链抗体）分子量约为15kDa，具有更强的稳定性，现在被广泛的应用于CAR-T的先导抗体开发。泰克生物通过自有羊驼基地，能为客户提供背景纯净，来源清晰的健康羊驼进行纳米抗体（VHH抗体）发现服务。

█ CAR细胞先导抗体药物发现服务

泰克生物为客户提供CAR细胞先导抗体发现的服务，详情请见下表：

驼源纳米抗体开发服务

scFv抗体开发服务

█ CAR细胞活性鉴定服务

CAR-T项目服务流程-泰克生物.png

图1 泰克生物CAR-T/NK项目服务流程

针对CAR-T/NK泰克生物能够提供的增值服务：

-- CAR表达测试

-- 靶点蛋白与先导抗体抗原识别区专属性

-- 针对先导抗体抗原识别区的抗独特性（Anti-idiotype）测试

-- 针对不同靶点蛋白的Fab形式抗体抗原识别区检测

-- 细胞因子释放试验

①　细胞因子种类：Y链共受体家族、IL-12家族、IL-1超家族等

②　方法：酶联免疫斑点试验（ELISpot）、细胞内细胞因子染色试验（ICS）、流式细胞术等

-- 体外细胞毒性试验

泰克生物能够提供体外细胞毒性试验，以验证评估CAR-T细胞的细胞毒性和可能的不良反应。例如，CAR-T细胞疗法可能会引起的一些急性的靶向/肿瘤毒性（细胞因子释放综合征、肿瘤溶解综合征）或靶向/非肿瘤毒性，以及由于CAR-T细胞经历抗原-独立增殖可能会增加细胞介导的毒性而导致的CAR-T细胞永生失败。

-- CAR细胞增殖试验

泰克生物开发的第二代和第三代CAR产品，能够增强CAR-T细胞或NK细胞增殖的持久性，并且泰克生物能够通过不同的测定方法对这种活化和增殖过程进行评估，例如 MTT、MTS、细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)、5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 结合流式细胞术分析等技术。

-- 活力和生物分布分析

泰克生物能够提供活力和生物分布分析，以验证评估CAR-T细胞在生理条件下的正常增殖能力，为 CAR-T细胞疗法提供临床前服务。例如，针对CAR-T细胞有限的复制寿命而导致的疗效减弱的CAR-T细胞疗法障碍，活力和生物分布分析为CAR-T细胞的长期治疗效果评估提供重要支持。

█ 免疫治疗性细胞（CAR-T/NK）开发服务平台优势

一站式的开发技术服务

丰富的经验积累，成熟的技术路线

严格的质控体系：标准硬件设施平台，

满足cGMP的文件关键管理规则，可提

供手写实验记录本

服务可定制：根据客户需求制备，为每

一个客户量身定制实验方案，满足每一

位客户的特殊需求

免疫CAR细胞制备技术服务常见问题解答

什么是CAR-T先导序列开发服务？

答：CAR-T 细胞是通过对T细胞进行基因改造产生的，通过包含嵌合抗原受体（CAR）来重新激活 T 细胞以识别肿瘤。CAR-T细胞疗法已经开发了30多年，并在临床上取得了令人鼓舞的治疗效果。目前，已经开发了五代具有不同特性的 CAR-T。第一代 CAR-T 的细胞内激活效率相对较低。通过添加共刺激分子来生产第二代CAR-T，提高激活效率。第三代CAR-T也是在第一代的基础上开发的，通过整合多个信号域作为共刺激分子。然而，第三代 CAR-T 并没有表现出比第二代更好的激活效率。此外，在第二代 CAR-T 的基础上，通过整合一些特定的细胞因子（如 IL-12）产生第四代，不仅增强了抗癌效果。此后，通过在 CD3ζ 和 CD28 的结构域之间插入白细胞介素 2 β受体链，并在 CD3ζ 末端添加转录因子 STAT3 和 STAT5 来提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤功效，从而产生第五代 CAR-T 细胞。
增强CAR-T持久性的策略？

答：在CAR-T细胞扩增阶段实施的干预措施，对输注后的长期存续至关重要。借助精密的工程手段，我们调整了CAR-T细胞的成长与分化路径，旨在提升其抗肿瘤效能。总体上，细胞在培育阶段彰显出卓越的增殖与分化潜能。这一过程中，效应功能的发挥与长期存续性之间存在着微妙平衡。T细胞的质量属性及特性，对于治疗的效果具有决定性意义。科研人员观察到，肌肽能够抑制细胞外酸化过程，促使代谢模式由酸性应激状态转向氧化高能状态。据此，肌肽的添加被证实能强化活化T细胞中的慢病毒基因转移效率。除这些特定的代谢物质外，生长因子能够参与其中。
CAR 基因的递送策略的什么？

答：病毒载体是 CAR 基因的主要递送平台。病毒载体，如γ逆转录病毒和慢病毒载体，可以有效地感染细胞。然而，病毒颗粒的包装复杂、昂贵且耗时，并且具有很高的感染污染风险。此外，由于病毒载体的载量能力较低，它们在帮助同时表达多个基因方面存在局限性，并且随机插入的风险也更高。研究人员开发了各种非病毒载体递送方法，包括转座子递送。与病毒载体相比，转座子介导的 CAR 基因递送具有更安全、表达效率高、成本更低、免疫原性低等优点。近年来，人们研究了脂质纳米颗粒（LNP）等纳米材料来递送 CAR 基因。然而，它们也存在缺点，包括瞬时蛋白表达引起的低持久性和复杂的制备过程。CAR-T 细胞也可以通过基因编辑技术（如 TALEN 和 CRISPR/Cas9）获得，这可以促进 CAR 基因在固定点与基因组的任何部分结合。基因编辑介导的 CAR-T 细胞生成更安全、更有效。许多已经开发的递送策略需要进一步优化，以有效地递送 CAR 基因并促进 CAR-T 细胞疗法在人类疾病中的临床应用。
CAR-T先导序列开发服务过程中会遇到哪些问题？如何解决？

答：肿瘤细胞的异质性导致靶点选择困难，不同患者甚至同一患者的不同肿瘤细胞之间可能存在抗原表达的差异。某些靶点可能在正常组织中也有表达，导致脱靶效应和潜在副作用。筛选过程中可能遇到假阳性或假阴性结果，影响最终抗体的选择。我们采用高通量筛选技术，如流式细胞术、荧光共振能量转移（FRET）等，提高筛选效率。基于抗体序列和结构信息，设计和构建突变抗体库。对人源化抗体进行严格的生物学活性评估，确保其功能不受影响。采用自动化的细胞分离、激活和扩增设备，提高制备效率和一致性。优化基因修饰方法，如使用非病毒载体或CRISPR/Cas9基因编辑技术。开展长期的临床试验，跟踪和评估CAR-T细胞治疗的安全性和有效性。建立完善的细胞因子释放综合征（CRS）等副作用的监测和处理机制，确保患者的安全。通过单细胞测序等技术手段，深入了解CAR-T细胞在体内的行为和机制。
该疗法的缺点是什么？如何解决？

答：在时间维度上，CAR-T 细胞活性延长或过度会导致细胞因子的过度释放和免疫系统的过度激活。CRS 是主要的毒性反应，在一些临床试验中，3 级或以上 CRS 的发生率已达到 30%。在空间维度上，CAR-T 细胞可能定位于表达靶抗原的正常细胞并不受控制地激活，从而导致 OTOT 毒性。所有这些抗原在正常组织中都表现出一定程度的表达。尽管正常细胞中 TAA 的表达量大大低于肿瘤细胞中，但由于 CAR-T 细胞具有高敏感性，因此可以对低表达抗原产生反应。当暴露于抗原时，输注的 CAR-T 细胞会经历几个数量级的激活和增殖。将调节模块掺入 CAR-T 细胞中可用于实现调节激活。通过使用电路的逻辑门控原理来组合标准化的调节元件，可以创建基因电路。将这些遗传回路整合到 T 细胞中或对底盘 T 细胞进行修饰可用于有效解决安全问题。由于肿瘤微环境的特点是缺氧，因此将 CAR-T 细胞修饰为仅在缺氧微环境中发挥作用可以大大减少 OTOT 毒性的可能性，并扩大可用于治疗应用的靶抗原的范围。未来，CAR-T 细胞有望向更复杂的工程细胞发展。

什么是CAR-T先导序列开发服务？

答：CAR-T 细胞是通过对T细胞进行基因改造产生的，通过包含嵌合抗原受体（CAR）来重新激活 T 细胞以识别肿瘤。CAR-T细胞疗法已经开发了30多年，并在临床上取得了令人鼓舞的治疗效果。目前，已经开发了五代具有不同特性的 CAR-T。第一代 CAR-T 的细胞内激活效率相对较低。通过添加共刺激分子来生产第二代CAR-T，提高激活效率。第三代CAR-T也是在第一代的基础上开发的，通过整合多个信号域作为共刺激分子。然而，第三代 CAR-T 并没有表现出比第二代更好的激活效率。此外，在第二代 CAR-T 的基础上，通过整合一些特定的细胞因子（如 IL-12）产生第四代，不仅增强了抗癌效果。此后，通过在 CD3ζ 和 CD28 的结构域之间插入白细胞介素 2 β受体链，并在 CD3ζ 末端添加转录因子 STAT3 和 STAT5 来提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤功效，从而产生第五代 CAR-T 细胞。
增强CAR-T持久性的策略？

答：在CAR-T细胞扩增阶段实施的干预措施，对输注后的长期存续至关重要。借助精密的工程手段，我们调整了CAR-T细胞的成长与分化路径，旨在提升其抗肿瘤效能。总体上，细胞在培育阶段彰显出卓越的增殖与分化潜能。这一过程中，效应功能的发挥与长期存续性之间存在着微妙平衡。T细胞的质量属性及特性，对于治疗的效果具有决定性意义。科研人员观察到，肌肽能够抑制细胞外酸化过程，促使代谢模式由酸性应激状态转向氧化高能状态。据此，肌肽的添加被证实能强化活化T细胞中的慢病毒基因转移效率。除这些特定的代谢物质外，生长因子能够参与其中。
CAR 基因的递送策略的什么？

答：病毒载体是 CAR 基因的主要递送平台。病毒载体，如γ逆转录病毒和慢病毒载体，可以有效地感染细胞。然而，病毒颗粒的包装复杂、昂贵且耗时，并且具有很高的感染污染风险。此外，由于病毒载体的载量能力较低，它们在帮助同时表达多个基因方面存在局限性，并且随机插入的风险也更高。研究人员开发了各种非病毒载体递送方法，包括转座子递送。与病毒载体相比，转座子介导的 CAR 基因递送具有更安全、表达效率高、成本更低、免疫原性低等优点。近年来，人们研究了脂质纳米颗粒（LNP）等纳米材料来递送 CAR 基因。然而，它们也存在缺点，包括瞬时蛋白表达引起的低持久性和复杂的制备过程。CAR-T 细胞也可以通过基因编辑技术（如 TALEN 和 CRISPR/Cas9）获得，这可以促进 CAR 基因在固定点与基因组的任何部分结合。基因编辑介导的 CAR-T 细胞生成更安全、更有效。许多已经开发的递送策略需要进一步优化，以有效地递送 CAR 基因并促进 CAR-T 细胞疗法在人类疾病中的临床应用。
CAR-T先导序列开发服务过程中会遇到哪些问题？如何解决？

答：肿瘤细胞的异质性导致靶点选择困难，不同患者甚至同一患者的不同肿瘤细胞之间可能存在抗原表达的差异。某些靶点可能在正常组织中也有表达，导致脱靶效应和潜在副作用。筛选过程中可能遇到假阳性或假阴性结果，影响最终抗体的选择。我们采用高通量筛选技术，如流式细胞术、荧光共振能量转移（FRET）等，提高筛选效率。基于抗体序列和结构信息，设计和构建突变抗体库。对人源化抗体进行严格的生物学活性评估，确保其功能不受影响。采用自动化的细胞分离、激活和扩增设备，提高制备效率和一致性。优化基因修饰方法，如使用非病毒载体或CRISPR/Cas9基因编辑技术。开展长期的临床试验，跟踪和评估CAR-T细胞治疗的安全性和有效性。建立完善的细胞因子释放综合征（CRS）等副作用的监测和处理机制，确保患者的安全。通过单细胞测序等技术手段，深入了解CAR-T细胞在体内的行为和机制。
该疗法的缺点是什么？如何解决？

答：在时间维度上，CAR-T 细胞活性延长或过度会导致细胞因子的过度释放和免疫系统的过度激活。CRS 是主要的毒性反应，在一些临床试验中，3 级或以上 CRS 的发生率已达到 30%。在空间维度上，CAR-T 细胞可能定位于表达靶抗原的正常细胞并不受控制地激活，从而导致 OTOT 毒性。所有这些抗原在正常组织中都表现出一定程度的表达。尽管正常细胞中 TAA 的表达量大大低于肿瘤细胞中，但由于 CAR-T 细胞具有高敏感性，因此可以对低表达抗原产生反应。当暴露于抗原时，输注的 CAR-T 细胞会经历几个数量级的激活和增殖。将调节模块掺入 CAR-T 细胞中可用于实现调节激活。通过使用电路的逻辑门控原理来组合标准化的调节元件，可以创建基因电路。将这些遗传回路整合到 T 细胞中或对底盘 T 细胞进行修饰可用于有效解决安全问题。由于肿瘤微环境的特点是缺氧，因此将 CAR-T 细胞修饰为仅在缺氧微环境中发挥作用可以大大减少 OTOT 毒性的可能性，并扩大可用于治疗应用的靶抗原的范围。未来，CAR-T 细胞有望向更复杂的工程细胞发展。