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酵母双杂交（膜系统）服务

跨膜蛋白（如受体、通道蛋白）是药物作用的关键靶点，但其疏水性和位于细胞膜的特性，使得用传统酵母双杂交技术研究其相互作用异常困难。泰克生物提供的酵母双杂交膜系统（Split-Ubiquitin Y2H），专为在近天然的膜环境中验证膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-胞质蛋白的相互作用而设计。泰克生物凭借在酵母展示与杂交系统领域的深厚积累，为您提供从靶点验证、高质量文库构建到高效筛选的一站式解决方案，助力您攻克膜蛋白研究难关，加速药物靶点发现与机制研究。

█ 酵母双杂交技术（膜杂交系统）基本原理

与酵母单杂交技术类似，酵母双杂交基本原理上也是基于真核酵母中的转录激活因子具有两个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，AD），这两个结构域的功能相互不影响，单独作用时不能发生激活转录效应，只有当二者在同一个细胞中且在空间上充分接近的时候，才能行使完整的转录激活因子的活性，使得下游基因得到转录。因此验证定位于细胞核内部的互作时，酵母单杂交技术与双杂交技术均可以采用GAL4转录因子作为报告体系，这种验证具有很大的局限性，当我们需要验证胞质内蛋白的相互作用时，这个系统难以胜任。科学家为了解决这种问题，开创性的开发了核外双杂交技术（又称为：酵母双杂交-膜杂交系统）。泰克生物为客户提供高质量的酵母双杂交（膜系统）服务，Yeast two-hybrid based on membrane 即Y2Hm服务，包括已知蛋白的互作验证、酵母双杂交（膜系统）文库的构建与筛选、基于酵母双杂交原理的蛋白自身的转录激活验证、膜蛋白与膜蛋白/胞质蛋白的互作验证等。

图1 膜蛋白互作酵母双杂系统原理：

膜系统酵母双杂交技术-泰克生物1.png

膜蛋白互作酵母双杂系统是基于泛素（split-ubiquitin）介导的分离-合并-切割系统搭建的，泛素蛋白分成2个结构域：N端结构域（称为：Nub结构域）和C端结构域（称为：Cub结构域），这两个结构域在同一个细胞内部靠近后能够形成完整的泛素蛋白，泛素蛋白可以被泛素特异性蛋白酶（UBP，ubiquitin binding proteins; 该酶识别完整的泛素蛋白）识别。在膜蛋白互作酵母双杂交系统中，将一种目标蛋白（Prey蛋白：膜蛋白或细胞质蛋白）融合到泛素蛋白Nub结构域的C端（NubG/NubA，是将泛素分子被截断后的N端进行改造，从而降低Cub与Nub两者之间的亲和性，避免其发生自发重组现象）；将另外一种蛋白（bait蛋白：饵蛋白）连接到Cub结构域的N端，在Cub结构域的C端融合一个人工设计的转录因子蛋白（由细菌lexA的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域组成）。当两种蛋白相互结合时，Nub和Cub结构相互靠近，被泛素特异性蛋白酶识别，然后切割泛素融合蛋白，释放转录因子，转录因子进入细胞核后结合到特定的报告基因上游，进行报告基因的转录和表达。

█ 酵母双杂交技术（膜杂交系统）筛选流程

膜系统酵母双杂交技术-泰克生物2.png

图2 膜蛋白杂交酵母杂交系统流程图

泰克生物建立了基于酵母双杂交（膜系统）的膜蛋白互作验证平台、膜蛋白和胞质蛋白互作验证平台、酵母双杂交cDNA文库构建与筛选平台（可发现众多天然的、潜在的互作蛋白）。泰克生物构建的酵母双杂交cDNA文库/多肽文库的库容可达10^7-10^8，文库多样性、插入率均可达90%以上，满足各类客户对于酵母双杂交（膜系统）文库的质量要求。同时，泰克生物还能提供酵母双杂交（膜系统）文库构建与筛选的配套的下游表达验证和亲和力测定验证等一站式技术服务，客户只需要提供具体的靶蛋白序列信息、需要构建的文库种类以及样本信息，泰克生物的科学家均能够根据客户的需求进行合理的方案设计和个性化定制，助力客户的科研项目。

█ 酵母双杂交技术服务适样品要求

动物组织	单个样品>0.1g；样品尽量新鲜	-80℃保存
种子	单个样品>0.2g	-80℃保存
细胞	(1) total RNA：10^6 cell/指标； (2) 浆/核RNA或蛋白：10^7 cell/指标 (3) 线粒体RNA或蛋白：2*10^7 cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol或直接冻存于-80℃ (4) 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量	-80℃保存
全血	(1) 用抗凝管保存的外周血5~10ml，骨髓1~3ml；-80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μL，每400μL加入 400μLTrizol	-80℃保存
植物组织	单个样品>1g；尽量新鲜	-80℃保存

█ 酵母双杂交服务内容和周期

步骤

服务内容

周期

选择1：酵母双杂交文库构建

(1) 总RNA提取（+mRNA纯化制备）；

(2) 高保真RT-PCR制备cDNA；cDNA第二链合成；

(3) 三框阅读框引物PCR+载体构建与转化：载体构建+初级文库鉴定（文库质粒扩增+测序与分析）；

(4) 次级酵母文库电转制备+文库鉴定文库质粒扩增+测序与分析）；

5) 交付：酵母文库质粒1管（>500ug），酵母文库甘油菌10-20ml，实验报告；

4-6周

选择2：酵母双杂交文库筛选

(1) 诱饵质粒合成；

(2) 自激活验证+毒性验证+功能验证；

(3) 酵母筛选+复筛+阳性克隆测序+点对点验证；

(4) 交付：实验报告、测序原始数据；

7-10周

█ 酵母双杂交术平服务优势

专为膜蛋白优化的系统

高标准文库构建能力

全流程项目支持与质控

从筛选到验证的一站式服务

采用分裂泛素（Split-Ubiquitin）核心系统，确保膜蛋白正确折叠并定位于酵母细胞膜，实现生理相关性更高的互作检测。

文库库容高达 10^7 – 10^8，插入率与多样性均 >90%。采用多步质控，确保文库质量，为筛选出低丰度互作蛋白奠定基础。

提供从“诱饵”蛋白自激活/毒性测试、

筛选条件优化到阳性克隆点对点验证的完整服务。实验记录全程可追溯。

可提供后续的蛋白表达纯化、

亲和力测定（如SPR）等下游验证服务，形成完整证据链，加速您的课题进展。

酵母双杂交（膜系统）服务常见问题解答

我的靶点是跨膜受体，传统酵母双杂交做不了，你们的膜系统一定能成功吗？

答：我们的膜系统（分裂泛素系统）正是为此类难题设计的。成功率取决于多个因素，我们会通过严格的预实验来评估：首先，我们会免费协助分析您的靶点序列，评估其在酵母中表达的可能性；其次，在项目开始前，必须进行“诱饵”蛋白的自激活和毒性测试，只有通过测试的构建才会进入正式筛选，这能极大避免后期失败的风险。对于有挑战性的靶点，我们的科学家会提供专业的构建优化建议。
与竞争对手相比，你们在酵母双杂交膜系统服务上的最大特色是什么？

答：我们的特色在于 “技术专注”与“服务延伸”。技术上，我们深耕酵母系统多年，不仅提供标准服务，更擅长处理难表达膜蛋白、弱相互作用等复杂案例。服务上，我们不局限于交付数据，而是致力于成为您的研发伙伴，提供从方案设计、难题攻关到下游验证的全程深度支持，确保您获得可发表、可延续的研究成果。
我想同时筛选多个候选靶点或使用特定组织的文库，能否提供定制方案？

答：当然可以。我们高度定制化的服务包括：1）多靶点并行筛选：可为您同时构建和测试多个“诱饵”蛋白，提升研发效率；2）定制化文库构建：您可提供特定的组织、细胞系或疾病状态的样本，我们为您构建专属的cDNA文库，更精准地发现特定生理病理条件下的互作蛋白。请直接联系我们的科学家团队，详细探讨您的需求。
你们提供的“阳性克隆测序报告”之后，还能提供哪些更深度的数据分析或验证支持？

答：基础交付包含测序序列和比对结果。此外，我们可提供增值的生物信息学分析，如对候选互作蛋白进行结构域预测、亚细胞定位分析和已知互作网络检索。更重要的是，我们提供一站式的下游实验验证服务，包括：阳性互作的点对点回转验证、利用Pull-down或Co-IP技术在哺乳动物细胞中进行正交验证，甚至进行初步的功能缺失/获得型实验，帮助您将“候选者”快速转化为“功能验证者”。
酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法有何不同？

答：酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法主要的区别在于目标蛋白的定位和相互作用的研究环境。传统的酵母双杂交技术通常用于研究溶解性蛋白质的相互作用，而酵母双杂交膜系统专注于研究膜蛋白之间的相互作用。膜蛋白的特殊性在于其嵌入细胞膜中，通常存在于膜的疏水区域，传统的酵母双杂交系统无法有效处理这种蛋白质的特性。膜系统通过将膜蛋白置于类似于天然细胞膜的环境中，使其能够保持正确的构象，增强了膜蛋白之间的相互作用识别能力。因此，酵母双杂交膜系统特别适合于研究膜蛋白的相互作用，包括受体、转运蛋白、信号传导蛋白等。
构建一个膜系统文库周期需要4-6周，时间能否缩短？如果筛选不出阳性结果怎么办？

答：4-6周是保障高质量文库构建的标准周期。若您急需，我们可提供加急服务（需评估样本状态）。关于筛选结果，我们会通过设置严谨的阴阳性对照、使用高多样性文库来最大化成功概率。若未筛到阳性克隆，我们将提供全面的实验数据记录，并与您共同分析可能原因（如互作强度极弱、蛋白表达问题），并讨论优化重筛或替代方案，确保您的研发投入获得清晰明确的后续指导。

我的靶点是跨膜受体，传统酵母双杂交做不了，你们的膜系统一定能成功吗？

答：我们的膜系统（分裂泛素系统）正是为此类难题设计的。成功率取决于多个因素，我们会通过严格的预实验来评估：首先，我们会免费协助分析您的靶点序列，评估其在酵母中表达的可能性；其次，在项目开始前，必须进行“诱饵”蛋白的自激活和毒性测试，只有通过测试的构建才会进入正式筛选，这能极大避免后期失败的风险。对于有挑战性的靶点，我们的科学家会提供专业的构建优化建议。
与竞争对手相比，你们在酵母双杂交膜系统服务上的最大特色是什么？

答：我们的特色在于 “技术专注”与“服务延伸”。技术上，我们深耕酵母系统多年，不仅提供标准服务，更擅长处理难表达膜蛋白、弱相互作用等复杂案例。服务上，我们不局限于交付数据，而是致力于成为您的研发伙伴，提供从方案设计、难题攻关到下游验证的全程深度支持，确保您获得可发表、可延续的研究成果。
我想同时筛选多个候选靶点或使用特定组织的文库，能否提供定制方案？

答：当然可以。我们高度定制化的服务包括：1）多靶点并行筛选：可为您同时构建和测试多个“诱饵”蛋白，提升研发效率；2）定制化文库构建：您可提供特定的组织、细胞系或疾病状态的样本，我们为您构建专属的cDNA文库，更精准地发现特定生理病理条件下的互作蛋白。请直接联系我们的科学家团队，详细探讨您的需求。
你们提供的“阳性克隆测序报告”之后，还能提供哪些更深度的数据分析或验证支持？

答：基础交付包含测序序列和比对结果。此外，我们可提供增值的生物信息学分析，如对候选互作蛋白进行结构域预测、亚细胞定位分析和已知互作网络检索。更重要的是，我们提供一站式的下游实验验证服务，包括：阳性互作的点对点回转验证、利用Pull-down或Co-IP技术在哺乳动物细胞中进行正交验证，甚至进行初步的功能缺失/获得型实验，帮助您将“候选者”快速转化为“功能验证者”。
酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法有何不同？

答：酵母双杂交膜系统与传统的酵母双杂交方法主要的区别在于目标蛋白的定位和相互作用的研究环境。传统的酵母双杂交技术通常用于研究溶解性蛋白质的相互作用，而酵母双杂交膜系统专注于研究膜蛋白之间的相互作用。膜蛋白的特殊性在于其嵌入细胞膜中，通常存在于膜的疏水区域，传统的酵母双杂交系统无法有效处理这种蛋白质的特性。膜系统通过将膜蛋白置于类似于天然细胞膜的环境中，使其能够保持正确的构象，增强了膜蛋白之间的相互作用识别能力。因此，酵母双杂交膜系统特别适合于研究膜蛋白的相互作用，包括受体、转运蛋白、信号传导蛋白等。
构建一个膜系统文库周期需要4-6周，时间能否缩短？如果筛选不出阳性结果怎么办？

答：4-6周是保障高质量文库构建的标准周期。若您急需，我们可提供加急服务（需评估样本状态）。关于筛选结果，我们会通过设置严谨的阴阳性对照、使用高多样性文库来最大化成功概率。若未筛到阳性克隆，我们将提供全面的实验数据记录，并与您共同分析可能原因（如互作强度极弱、蛋白表达问题），并讨论优化重筛或替代方案，确保您的研发投入获得清晰明确的后续指导。

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