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纳米抗体酵母展示开发服务
泰克生物为满足客户的定制化需求,我们开发了基于流式分选技术(FACS)的酵母表面展示体系的文库高通量筛选技术平台,满足部分客户需要兼顾亲和力前置分级筛选的纳米抗体开发要求。该技术平台可以为客户提供驼源VHH纳米抗体开发服务,不同物种(兔源、鼠源、羊源和驼源等)scFv发现服务以及蛋白突变体进化发现服务。
█ 基于酵母表面展示技术的开发服务
泰克生物可为客户提供酵母表面展示技术的驼源VHH纳米抗体开发服务。通过PCR技术将来自驼源的VHH抗体基因插入到凝集素Aga2p基因的末端进行融合表达,如图1所示,Aga2p蛋白亚基通过两个二硫键与固定在酵母细胞壁上的Aga1p 蛋白亚基结合,结合流式分选技术,将靶向抗原的特异性抗体筛选出来。
图1 VHH纳米抗体酵母展示原理示意图
基于酵母体展示技术(Yeast Technology),泰克生物能够为客户提供高质量的VHH纳米抗体酵母展示服务,文库库容达10^8,文库多样性、插入率、阳性率均可达90%以上,以满足各类客户对于抗体酵母展示文库的质量要求。
█ 酵母展示纳米抗体开发服务
泰克生物拥有2个动物免疫基地,保证客户项目中免疫的动物背景来源清晰且健康。VHH分子量大小约15kDa,是驼源动物特有的一种抗体重链可变区,在药物靶点抗体开发、CAR-T/CAR-NK治疗性抗体等方面具有天然的优势。酵母展示文库相对噬菌体展示文库技术而言,前者在微量抗体表达后抗体活性层面相较于后者要高,得益此基础,在流式筛选时就能不同亲和力的抗体进行分群。VHH纳米抗体酵母展示发现路径如图2所示:
图2基于酵母技术平台的VHH纳米抗体发现服务
█ 服务内容和周期
步骤 | 服务内容 | QC标准 | 周期 |
Step1:抗原准备 | *抗原类型: (1) 重组蛋白制备 (2) 小分子(改造)+偶联 (3) 多肽合成+偶联 (4) 客户提供灭活病毒 (5) 客户提供封装好的mRNA | 1) 重组蛋白(纯度>85%); 2) 小分子纯度>90%; 3) 多肽纯度>90%;
| 4-6周 |
Step2:动物免疫 | (1) 动物免疫4次,加强免疫一针,共计免疫5针; (2) 免疫前采集阴性血清,第4针采血进行ELISA检测血清效价; (3) 若第4针血清抗体效价满足要求,则采血前7天再次加强免疫1针,如不满足要求,则继续常规免疫; (4) 效价合格,采血分离单核细胞; | 1) 动物:背景清晰; 2) 免疫:蛋白/病毒抗原效价检测;多肽/小分子抗原效价检测; | 10周 |
Step3: cDNA制备 | (1) PBMC总RNA提取 (2) 高保真RT-PCR制备cDNA | 1) PBMC细胞质控; 2) Total RNA质控; 3) cDNA质控; | 1 天 |
Step4:抗体酵母展示文库构建 | (1) 以文库cDNA为模板,两轮PCR法扩增VHH基因 (2) 酵母展示载体构建与转化: VHH基因拼接酵母展示载体,电击转化酵母菌,构建抗体库 (3) 鉴定:随机挑选克隆,PCR鉴定阳性率;测序计算插入正确率和文库多样性 | 1) 文库阳性率检测; 2) 文库插入性率检测; 3) 库容检测+序列检测 | 3-4周 |
Step5:文库筛选 | (1) 荧光标记蛋白FACS筛选; (2) 根据要求进行不同亲和力群体NGS测序;同时挑单克隆诱导表达+ELISA检测阳性克隆; (3) 阳性克隆进行基因测序; | 1) 双阳性菌株设定; 2) VHH序列筛选标准设定 | 3-4周 |
Step6:抗体验证 | (1) 抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体定量; (2) ELISA验证抗体与抗原结合(交付EC50数据); (3) BLI法验证抗体亲和力; (4) 细胞功能验证:流式阻断验证; | 1) 重组抗体表达质控; 2) EC50 验证 3) 快速亲和力测定结果; 4) 阻断验证结果; | 4-6周 |
泰克生物为客户进行初步成药性评价后,还能提供抗体人源化、抗体亲和力成熟、CAR-T/CAR-NK先导序列设计及细胞杀伤验证等一站式技术服务,根据客户的需求进行合理的方案设计和个性化定制,为客户的科研项目及药物抗体开发助力。
█ 服务优势
拥有免疫基地:动物资 源充足,包括驼源、鼠 源、兔源以及羊源等 | 多种抗体库酵母展示可 选:VHH抗体库展示、 scFv抗体库展示等 | 多种靶点抗体发现服务 可选:蛋白、多肽、小 分子、病毒、膜蛋白、 mRNA等 | 技术平台成熟:免疫文 库库容10^8-10^9,亲 和力直接分群筛选 | 实验记录可追溯:中英 文实验报告,原始实验 记录 | 个性化方案定制,满足 各类客户科研项目需求 |
█ 酵母表面展示技术平台服务优势
疏水性序列展示情况优秀,适用于TCR的表面展示 | 灵活配置单双荧光筛选体系,筛选抗原需求量少 | 筛选过程过程中可区分亲和力群体 |
答:纳米抗体酵母展示开发服务是通过酵母展示平台筛选和优化纳米抗体的一种技术。在该过程中,首先将纳米抗体基因库克隆到酵母表达载体中,使得每个酵母细胞表面展示出一个特定的纳米抗体。通过这种方式,可以构建出一个多样化的纳米抗体库,具有针对不同抗原的广泛特异性。在筛选过程中,使用目标抗原或目标分子与展示在酵母细胞表面的纳米抗体进行结合反应,只有与抗原有高亲和力和特异性结合的酵母细胞才能被筛选出来。最终,通过高通量筛选和克隆分离,获得一系列具有高亲和力和高特异性的纳米抗体。酵母展示平台的优势在于其能够通过高效的分选和筛选技术,快速找到符合需求的纳米抗体,并进行进一步优化和验证。
答:纳米抗体酵母展示开发服务具有许多显著优势。首先,酵母细胞作为真核表达系统,能够正确地折叠和修饰纳米抗体,特别是可以进行糖基化等后修饰,这对于某些纳米抗体的稳定性和亲和力至关重要。相比之下,原核系统(如大肠杆菌)无法提供这些复杂的后修饰,因此酵母展示技术在一些高要求的应用中具有更大的优势。其次,酵母展示平台具备高通量筛选能力,能够在较短时间内筛选出大量高亲和力的纳米抗体。此外,酵母细胞的转化效率相对较高,能够构建较大的纳米抗体库,为客户提供多样化的选择。最后,酵母展示技术可以在较低的成本下完成抗体筛选,并且实验操作较为简便,适用于大规模的抗体开发和优化工作。
答:首先,客户提供目标抗原或目标分子,研究团队根据抗原的特性设计合适的筛选条件。纳米抗体基因库通过基因工程被导入酵母细胞并在其表面展示,构建了一个多样化的纳米抗体库。筛选过程通常通过流式细胞术等高通量方法完成,利用抗原与展示在酵母细胞表面的纳米抗体结合后,通过细胞的荧光标记进行分选,筛选出与抗原结合的纳米抗体。随着筛选的多轮进行,能够逐步提高筛选出抗原亲和力更高、更特异性的纳米抗体。同时,优化过程中还会根据需要进行亲和力成熟、糖基化修饰和稳定性优化等手段,进一步提高纳米抗体的功能特性。最终,筛选和优化的纳米抗体经过克隆和验证,确保其具有较高的抗原结合能力和应用潜力。
答:纳米抗体酵母展示开发服务可以广泛应用于多个领域,尤其是在抗体发现、疫苗开发、靶向治疗和诊断等方面。首先,在抗体发现中,酵母展示技术能够快速筛选出针对特定抗原的高亲和力纳米抗体,广泛应用于癌症、传染病和免疫疾病等的治疗中。其次,纳米抗体作为疫苗和诊断试剂的载体,能够在高效识别靶标分子的同时,避免传统抗体较大尺寸的限制,因此在开发小分子疫苗和高灵敏度诊断工具中具有独特优势。纳米抗体还被用于生物标志物的检测、疾病早期诊断和治疗监测中。此外,纳米抗体由于其独特的稳定性和小尺寸,能够在恶劣环境中保持活性,因此在蛋白质工程和酶催化领域也有广泛的应用。
答:尽管纳米抗体酵母展示开发服务具有许多优势,但也存在一定的局限性。首先,酵母展示技术在展示非常大或复杂的抗体片段时可能受到一定限制,尤其是对于那些结构较复杂或需要特殊折叠的抗体,酵母可能无法正确展示其功能,这可能导致筛选结果不理想。其次,酵母展示技术对抗体库的大小有一定限制,虽然酵母细胞能够承载较大的库,但与噬菌体展示技术相比,酵母展示的库容量通常较小,可能需要更高效的筛选技术来弥补这一不足。此外,酵母细胞的培养和筛选过程需要一定的实验条件和时间,尤其是在进行多轮筛选时,可能会涉及较为繁琐的操作步骤,导致开发周期较长。最后,尽管酵母展示能够进行一定的后修饰(如糖基化),但与哺乳动物细胞系统相比,酵母在某些后修饰方面的能力仍然有限,这可能对某些特殊应用的纳米抗体的功能产生影响。
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