scFv抗体开发服务-泰克生物-酵母展示服务专家

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scFv抗体开发服务

泰克生物致力于为客户提供高亲和力、高特异性的抗体药物前期发现技术服务，为客户后续的CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体开发以及高效阻断型中和抗体开发等下游研发工作提供有力支持。泰克生物在药物抗体发现方面拥有10年的项目开发经验和心得，能够为客户提供高质量的针对包括但不限于蛋白、多肽、小分子、病毒、膜蛋白以及mRNA等靶点且来自不同物种（兔源、鼠源、人源等）scFv发现服务。

█ scFv抗体开发技术服务

泰克生物可为客户提供scFv抗体文库构建以及筛选服务。利用引物组合PCR技术分别获得不同物种中抗体VH区和VL区（Kappa和lambda链）种系基因片段，通过重叠PCR方法获得scFv抗体后，插入到M13噬菌体的P3蛋白的N端，使scFv抗体基因随P3蛋白的表达而展示到噬菌体表面，最后通过类似于“钓鱼”的淘筛方式筛选出跟靶点抗原结合的scFv抗体。相比较于酵母抗体展示技术，scFv形式由于多样性高，因此对文库库容以及多样性展现要求高，基于噬菌体展示技术的scFv抗体文库库容轻松达到10^9-10^10，文库多样性容易>90%，是比较合适的展示体系。噬菌体展示scFv文库在筛选层面，也更容易采用细胞系，VLP之类的靶目标物进行筛选。scFv抗体发现服务噬菌体展示发现路径如图1所示：

scFv抗体发现服务-泰克生物.png

图1基于噬菌体技术平台的scFv抗体发现服务

█ scFv技术抗体开发服务宿主类型

泰克生物为客户提供基于M13噬菌体展示体系的scFv抗体发现服务，如图2或表1所示：

表1 ScFv抗体发现类型

抗体形式	物种来源	文库类型
scFv抗体形式	人	天然
	鼠	免疫/天然
	兔	免疫/天然
	羊	免疫/天然
Fab形式抗体	人	天然
	鼠	免疫/天然
	兔	免疫/天然

ScFv抗体发现类型-泰克生物.png

图2 ScFv抗体发现类型

█ scFv抗体开发服务内容和周期

步骤	服务内容	QC检测	周期
Step1：抗原准备	*抗原类型： (1) 重组蛋白制备 (2) 小分子（改造）+偶联 (3) 多肽合成+偶联 (4) 客户提供灭活病毒 (5) 客户提供封装好的mRNA	1) 重组蛋白(纯度>85%)； 2) 小分子纯度>90%； 3) 多肽纯度>90%；	4-6周
Step2:动物免疫	(1) 动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针； (2) 免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价； (3) 若第4针血清抗体效价满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫； (4) 效价合格，采血分离单核细胞；	1) 动物：背景清晰； 2) 免疫：蛋白/病毒抗原效价检测；多肽/小分子抗原效价检测；	8-10周
Step3:模板cDNA制备	(1) PBMC总RNA提取 (2) 高保真RT-PCR制备cDNA	1) PBMC细胞质控； 2) Total RNA质控； 3) cDNA质控；	1 天
Step4:噬菌体展示文库构建	(1) 以cDNA为模板，组合引物多轮PCR法扩增VH和VL基因； (2) 噬粒构建与转化： VH-VL基因拼接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库； (3) 鉴定：随机挑选克隆，PCR鉴定阳性率+插入率 (4) 辅助噬菌体准备：M13噬菌体扩增+纯化； (5) scFv展示文库救援	1) 文库阳性率检测； 2) 文库插入性率检测； 3) 库容检测+序列检测	2-3周
Step5:文库筛选	(1) 抗原包被（单个蛋白筛选，常规默认是固相筛选法或磁珠分选）； (2) 默认3-5轮筛选：压力筛选，最大限度去除非特异性抗体； (3) 挑取单个克隆扩增噬菌体+诱导表达+ELISA检测阳性克隆； (4) 挑取全部阳性克隆进行基因测序；	1) ELISA阳性标准设定； 2) VHH筛选标准设定	2-3周
Step6:成药性评价	(1) 将获得的抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量； (2) ELISA验证抗体与抗原结合; (3) BLI法验证抗体亲和力； (4) 细胞功能验证：流式阻断验证；	1) 重组抗体表达质控； 2) EC50 验证 3) 快速亲和力测定结果； 4) 阻断验证结果；	4-6周

注：客户可以根据自己的需求进行上述服务步骤的选择

█ scFv抗体开发服务优势


拥有免疫基地：动物资源充足，包括但不限于驼源、鼠源、兔源以及羊源等	开发周期短：获得PBMC后，建库到筛选获得抗体序列4-6周	多种靶点抗体发现服务可选：蛋白、多肽、小分子、病毒、膜蛋白、mRNA等	技术平台成熟：免疫文库库容 10^9-10^10，天然文库库容 10^10-10^12

文库筛选方式多样性：根据客户项目需求设计最佳的筛选方式，如固相筛选、液相筛选、细胞筛选、磁珠筛选等	实验记录可追溯：QC质控标准（免疫效价、PBMC质控、文库质控及筛选验证质控），中英文实验报告，原始实验记录	一对一个性化方案定制（包括免疫方案、建库方案、筛选方案以及后续的体外表达验证方案等），满足各类客户的科研项目需求	可提供一系列配套的下游药物抗体开发服务，抗体体外表达验证、抗体人源化、抗体亲和力成熟、双特异性抗体开发、CAR-T先导序列分子设计等

scFv抗体开发服务常见问题解答

scFv抗体发现服务的优势

答：scfv抗体与单抗相比具有许多优点，首先scfv抗体稳定性强，可以在4℃下储存数年。同时scfv抗体的基因容易操纵，scfv抗体可以绕过杂交瘤和免疫来产生。此外，scFv的更高亲和力突变体可以通过定点诱变产生，这更容易和更简单地进行。scFv 是抗体的最小功能单位，由于其特殊特性，包括与母体 Ig 相比，肿瘤穿透率更高和清除率快，因此在癌症放射免疫闪烁显像中显示出良好的前景。经过scFv抗体设计、抗体定制，使抗体能够在噬菌体上展示。scFv单链抗体在癌症治疗中扮演着重要角色，用来开发可治愈基因递送的靶向载体。scFv单链抗体还可以作为其他检测试剂。在过去几年中，通过scFv抗体定制产生的抗体已成为很多常见没有试剂的备选品。
什么是scFv抗体？

答：单链抗体主要由杂交瘤、鼠脾脏和人B细胞产生。scFv（单链片段可变区）是一种非共价异二聚体，由VH和VL结构域组成，其中可以用于构建重组scFv（单链片段可变区）抗体。scFv是由传统抗体的可变区改造而来，它们通过接头连接在一起，该接头可以在E.coli中表达的单链可变区抗体，使蛋白质工程能够改善特性。泰克生物有丰富的重组抗体定制项目，提供多种不同抗体定制的方法。同时，泰克生物提供scFv、Fab抗体定制服务和抗体人源化服务。泰克生物还提供包括抗原制备、scfv抗体设计、噬菌体文库构建、重组抗体纯化等全链条服务。
scFv抗体发现服务包含哪些主要环节？

答：为了获得scFv，首先分离信使核糖核酸，然后将其逆转录作为扩增模板。然后用RT-PCR技术分别扩增抗体的重链（VH）及轻链（VL）基因。通过基因技术将重链和轻链基因，形成我们需要的scFv基因片段，然后将其连接到载体上，使用这种方法，可以完成具有不同范围的scfv基因库构建。然后将其转化到将不同的宿主细胞中（比如大肠杆菌、酵母菌等），构建含有目的抗体片段的文库。然后泰克生物对scfv噬菌体文库进行反复多轮的淘洗和筛选富集，最后完成scfv抗体库构建，从构建好的抗体库中筛选出客户的目的scFv抗体片段，然后对scfv抗体序列进行测序和分析，确认其序列和特性。泰克生物根据客户要求对抗体进行纯化，然后将其交付给顾客。
scFv抗体的结构特殊性以及接头的作用？

答：ScFv，作为一种小分子基因工程抗体，其分子量仅为完整抗体的六分之一左右，赋予了它出众的穿透能力和较低的免疫原性。这种scFv抗体，由VH与VL经由一个灵活的肽连接段融合而成。该接头可以在E.coli中表达的单链可变区抗体，使蛋白质工程能够改善scFv的特性，如增加亲和力和改变特异性。scFv抗体中连接两个V结构域的柔性DNA接头的长度对于抗体的正确折叠是十分关键的。据分析，scFv抗体肽接头必须跨越可变区的羧基端和另一个结构域氨基端之间的3.5 nm（35 A），而且不能对结构域折叠产生影响也不能干扰形成完整抗原结合位点的能力。抗体上除去从头设计的接头肽之外，我们还可以应用衍生出的蛋白质结构的肽序列，用来在桥接scFv（单链片段可变区）的可变区中提供相容的长度和构象，从而稳定抗体空间结构，使其不发生改变。
scFv抗体发现服务中我们常常会遇到抗体出现亲和力低，稳定性差等情况，我们如何解决？

答：scFv抗体由于自身结构上的限制，它的亲和力相较于其他抗体是低的。同时scFv抗体在机体内容易发生降解，稳定性不好。泰克生物通过基因工程手段对scFv抗体的序列进行优化，来帮助scFv抗体亲和力增强。同时，泰克生物通过构建scFv的多聚体（如Diabodies、Tribodies）了增加抗体和抗原之间的结合价，从而提高亲和力。泰克生物也对scFv进行人源化改造，通过基因手段降低其免疫原性，同时可能提高抗体的亲和力。泰克生物选择合适的Linker可以帮助增加scFv抗体的稳定性，因为Linker的长度和组成对scFv的稳定性有重要影响。优化表达系统：同时，在不同的表达系统中scFv抗体的表达也是不相同的，可能出现表达量过低的情况。泰克生物通过尝试在原核系统（如E. coli）、酵母系统或哺乳动物细胞系统中表达scFv，以找到最适合的稳定表达条件。我们也通过抗体的两端添加保护基团，如PEG（聚乙二醇）修饰，帮助提高抗体在机体内的稳定性。

scFv抗体发现服务的优势

答：scfv抗体与单抗相比具有许多优点，首先scfv抗体稳定性强，可以在4℃下储存数年。同时scfv抗体的基因容易操纵，scfv抗体可以绕过杂交瘤和免疫来产生。此外，scFv的更高亲和力突变体可以通过定点诱变产生，这更容易和更简单地进行。scFv 是抗体的最小功能单位，由于其特殊特性，包括与母体 Ig 相比，肿瘤穿透率更高和清除率快，因此在癌症放射免疫闪烁显像中显示出良好的前景。经过scFv抗体设计、抗体定制，使抗体能够在噬菌体上展示。scFv单链抗体在癌症治疗中扮演着重要角色，用来开发可治愈基因递送的靶向载体。scFv单链抗体还可以作为其他检测试剂。在过去几年中，通过scFv抗体定制产生的抗体已成为很多常见没有试剂的备选品。
什么是scFv抗体？

答：单链抗体主要由杂交瘤、鼠脾脏和人B细胞产生。scFv（单链片段可变区）是一种非共价异二聚体，由VH和VL结构域组成，其中可以用于构建重组scFv（单链片段可变区）抗体。scFv是由传统抗体的可变区改造而来，它们通过接头连接在一起，该接头可以在E.coli中表达的单链可变区抗体，使蛋白质工程能够改善特性。泰克生物有丰富的重组抗体定制项目，提供多种不同抗体定制的方法。同时，泰克生物提供scFv、Fab抗体定制服务和抗体人源化服务。泰克生物还提供包括抗原制备、scfv抗体设计、噬菌体文库构建、重组抗体纯化等全链条服务。
scFv抗体发现服务包含哪些主要环节？

答：为了获得scFv，首先分离信使核糖核酸，然后将其逆转录作为扩增模板。然后用RT-PCR技术分别扩增抗体的重链（VH）及轻链（VL）基因。通过基因技术将重链和轻链基因，形成我们需要的scFv基因片段，然后将其连接到载体上，使用这种方法，可以完成具有不同范围的scfv基因库构建。然后将其转化到将不同的宿主细胞中（比如大肠杆菌、酵母菌等），构建含有目的抗体片段的文库。然后泰克生物对scfv噬菌体文库进行反复多轮的淘洗和筛选富集，最后完成scfv抗体库构建，从构建好的抗体库中筛选出客户的目的scFv抗体片段，然后对scfv抗体序列进行测序和分析，确认其序列和特性。泰克生物根据客户要求对抗体进行纯化，然后将其交付给顾客。
scFv抗体的结构特殊性以及接头的作用？

答：ScFv，作为一种小分子基因工程抗体，其分子量仅为完整抗体的六分之一左右，赋予了它出众的穿透能力和较低的免疫原性。这种scFv抗体，由VH与VL经由一个灵活的肽连接段融合而成。该接头可以在E.coli中表达的单链可变区抗体，使蛋白质工程能够改善scFv的特性，如增加亲和力和改变特异性。scFv抗体中连接两个V结构域的柔性DNA接头的长度对于抗体的正确折叠是十分关键的。据分析，scFv抗体肽接头必须跨越可变区的羧基端和另一个结构域氨基端之间的3.5 nm（35 A），而且不能对结构域折叠产生影响也不能干扰形成完整抗原结合位点的能力。抗体上除去从头设计的接头肽之外，我们还可以应用衍生出的蛋白质结构的肽序列，用来在桥接scFv（单链片段可变区）的可变区中提供相容的长度和构象，从而稳定抗体空间结构，使其不发生改变。
scFv抗体发现服务中我们常常会遇到抗体出现亲和力低，稳定性差等情况，我们如何解决？

答：scFv抗体由于自身结构上的限制，它的亲和力相较于其他抗体是低的。同时scFv抗体在机体内容易发生降解，稳定性不好。泰克生物通过基因工程手段对scFv抗体的序列进行优化，来帮助scFv抗体亲和力增强。同时，泰克生物通过构建scFv的多聚体（如Diabodies、Tribodies）了增加抗体和抗原之间的结合价，从而提高亲和力。泰克生物也对scFv进行人源化改造，通过基因手段降低其免疫原性，同时可能提高抗体的亲和力。泰克生物选择合适的Linker可以帮助增加scFv抗体的稳定性，因为Linker的长度和组成对scFv的稳定性有重要影响。优化表达系统：同时，在不同的表达系统中scFv抗体的表达也是不相同的，可能出现表达量过低的情况。泰克生物通过尝试在原核系统（如E. coli）、酵母系统或哺乳动物细胞系统中表达scFv，以找到最适合的稳定表达条件。我们也通过抗体的两端添加保护基团，如PEG（聚乙二醇）修饰，帮助提高抗体在机体内的稳定性。

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拥有免疫基地：动物资源充足，包括但不限于驼源、鼠源、兔源以及羊源等	开发周期短：获得PBMC后，建库到筛选获得抗体序列4-6周	多种靶点抗体发现服务可选：蛋白、多肽、小分子、病毒、膜蛋白、mRNA等	技术平台成熟：免疫文库库容 10^9-10^10，天然文库库容 10^10-10^12

文库筛选方式多样性：根据客户项目需求设计最佳的筛选方式，如固相筛选、液相筛选、细胞筛选、磁珠筛选等	实验记录可追溯：QC质控标准（免疫效价、PBMC质控、文库质控及筛选验证质控），中英文实验报告，原始实验记录	一对一个性化方案定制（包括免疫方案、建库方案、筛选方案以及后续的体外表达验证方案等），满足各类客户的科研项目需求	可提供一系列配套的下游药物抗体开发服务，抗体体外表达验证、抗体人源化、抗体亲和力成熟、双特异性抗体开发、CAR-T先导序列分子设计等

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