单链抗体文库构建技术介绍-纳米抗体专题-泰克生物-酵母展示服务专家

单链抗体文库构建技术介绍

利用抗体噬菌体展示技术的最新进展使得克服这些限制并产生识别任何所需抗原的人单克隆抗体成为可能。对于噬菌体展示，克隆了VH和VL基因的抗原结合区域并用于构建scFv/Fab基因库。噬菌体抗体库是通过克隆这些抗体库作为融合蛋白与噬菌体的一个次要外壳蛋白（pIII蛋白）。每个噬菌体表面都有一个功能性抗体蛋白，并含有编码抗体的基因，该抗体被整合到噬菌体基因组中。利用亲和层析技术可以从非结合噬菌体抗体中分离出特异性结合蛋白质和小分子的特定噬菌体抗体。该策略无需免疫，抗体基因克隆，抗体片段在大肠杆菌中表达良好。针对特定抗原产生的抗体的数量和亲和力是文库大小和多样性的函数，文库越大，产生的高亲和力抗体数量就越多。

一．scFv文库构建

免疫新西兰大白兔（不低于5针），ELISA检测抗体效价（>10^5），效价合格，采血分离PBMC。利用300 ng文库质粒DNA作为模板、Vent DNA聚合酶、CITE3引物和HuJH引物等摩尔混合物，从pCITE-VH文库中进行VH基因库PCR扩增。用于scFv组装的VL基因是从先前构建的scFv噬菌体抗体文库中获得的。利用Vent DNA聚合酶、Gene3引物和RHuJH引物等量混合物，从300 ng文库质粒DNA中扩增出VL基因库，包括编码scFv肽连接体的DNA。将扩增的VH和VL基因琼脂糖凝胶纯化，并用重叠延伸PCR将其拼接在一起，形成scFv基因库。示意图如下所示：

文库构建方法示意图-泰克生物.png

图1 文库构建方法示意图

注：（A）从不同文库的质粒DNA中PCR得到VH和linker-VL基因库。用质粒特异性引物和等量混合的HuJH引物扩增VH基因。用质粒特异性引物和等摩尔RHuJH引物混合扩增连接子DNA和VL基因。RHuJH引物与HuJH引物是互补的；（B）将VH和连接体DNA-VL基因库聚合成scFv基因库；（C）用限制性内切酶NcoI和NotI切割组装好的scFv基因库，克隆到质粒pHEN1中进行噬菌体展示。

二．scFv基因库的克隆

将scFv基因库的纯化DNA进行双酶切，并将酶切产物连接到用相同酶切的载体上。将连接产物纯化并电穿孔到大肠杆菌TG1中。细胞在SOC中培养1 h，然后在TYE-AG培养基（PharmaciaBiotech）上培养N板。对所有连接样品进行了10次以上的电穿孔，通过一系列的稀释来计算其转换效率。从第5个平板上刮取菌落，用含15% (v/v)甘油的YT-AG中重悬，在-70℃中保存文库。

三．scFv纯化和亲和性测定

需要对scFv基因进行了亚克隆、表达和纯化，以达到同质性。重组DNA和基因扩增技术使得在细菌中克隆抗体基因成为可能。这种抗体基因的“非死化”使得在细菌培养中快速产生抗体（或抗体片段）并从基因上操纵它们的结构在技术上是可行的，从而最终可以产生针对Y抗原的抗体，甚至可以设计出具有更高亲和力和更高特异性的更小的抗体。scFv解离平衡常数（Kd）由BIAcore中使用表面等离子体共振测定的缔合（kon）和解离（koff）速率常数计算得出。

利用免疫或非免疫动物或人淋巴细胞抗体可变区基因构建的重组噬菌体抗体文库，通过在噬菌体表面显示功能抗体片段和筛选具有抗原结合活性的融合噬菌体，是获得重组噬菌体抗体的有力途径。噬菌体系统的有用之处是，通过连接识别和复制，天然抗体系统的本质可以在噬菌体中复制。

泰克生物多年来致力于抗体领域研究。我们积累了丰富的抗体发现经验，能够为客户提供基于抗体噬菌体展示文库技术的single-chain Fv（scFv）抗体文库构建服务。单链抗体（scFv）具有分子量小，组织穿透力强，易于进行基因工程改造等优点。泰克生物利用抗体噬菌体展示文库技术，可以制备得到高亲和力，结构稳定的scFv抗体。

上一篇:纳米抗体原核表达下一篇:纳米抗体哺乳动物细胞表达