1985年,Smith通过基因工程技术改造丝状噬菌体,获得了能够在体外增殖的重组噬菌体,创建了噬菌体展示技术。1988年,通过将噬菌体的pⅢ蛋白N端与已知的抗原决定簇融合并呈现在噬菌体表面,能够使融合体特异性地与抗体结合,进而产生了通过噬菌体肽库构建去了解抗原表位的想法。作为研究抗原表位的技术,噬菌体展示主要是通过基因工程技术将外源基因插入到噬菌体衣壳蛋白,使得外源基因编码的多肽能够以融合蛋白进行展示,并且其本身的结构和活性不发生改变,之后通过多轮的筛选去选出能够与目标分子结合的高特异性的抗体或多肽。在1990年,基于噬菌体展示技术的随机6肽文库被创建,经过多年的发展,噬菌体展示技术除了被用于研究抗原表位,在细胞信号转导、蛋白的识别位点、药物研发等领域都进行了应用。基于噬菌体展示技术建立的肽库容量高达数十亿,在筛选多肽标志物方面,噬菌体展示肽库有着快速、成本相对较低、库容量大的优势。通过筛选与特定抗原结合的噬菌体多肽,可以开发新的抗体或者对现有的抗体进行改进,噬菌体展示多肽还可以用于疫苗研发、癌症诊断、生物传感器的开发等。
多肽文库的分类:
基于噬菌体展示的多肽文库主要是由不同长度的短肽序列组成,根据不同的构建方法和用途,多肽文库被分为不同的类型。重叠肽库是通过逐步截取蛋白序列的不同片段去进行噬菌体肽库构建,它主要用于全长蛋白,有助于进行连续的线性表位的识别。通过去除原多肽序列两侧的氨基酸来构建的肽库称为截断肽库,用于小范围的表位的确定,有助于与生物活性相关的氨基酸序列的鉴定。在丙氨酸肽扫描文库中,丙氨酸能够取代每一个氨基酸残基,从而了解每一个氨基酸所发挥的作用。随机多肽文库包含20种氨基酸所有可能排列的多肽的组合,由于这些多肽序列充满了随机性,因此随机多肽文库中包含了大量不同的多肽,能够通过随机多肽文库去发现更多具有特定功能或相互作用的多肽。乱序肽库能够对原有的氨基酸序列重新排列组合,变异性很高,通常被用作阴性对照,用来说明按照特定顺序去排列的氨基酸序列对于多肽的结构和功能的重要性。
按照线性排列的氨基酸构成的多肽文库称为线性肽库,它的结构简单,容易进行合成与表征,并且可以根据需要对氨基酸的序列与长度进行调整,主要用于研究蛋白质之间的相互作用,以及抗原表位的筛选。一些化学反应,例如酰胺键成环等,可以将线性肽库转变为具有环状结构的多肽链库,也就是环肽库,由于环化能够促进分子内氢键的结合,降低分子外部氢键的能力,提高蛋白抵抗能力,延长半衰期,因此环肽库的稳定性更强。由于环肽表面积相对较大,因此与受体结合的概率增加,甚至可以针对没有结合口袋的靶蛋白。不同的环化方式和环化结合位点可以产生大量的环肽分子,发现新配体的可能性也因此增加。部分环肽有较强的细胞穿透性和口服性,在治疗性药物研发方面具有潜在的应用价值。
多肽文库的合成与筛选:
噬菌体肽库构建的基本原理是通过创建包含大量的不同长度、氨基酸组成和结构的多肽序列的文库,再通过随机肽库筛选去鉴定出具有特定功能的多肽。合成步骤包括随机多肽序列的生成、多肽的合成,以及其在特定载体上的展示或表达。在构建12肽库时,首先利用算法生成大量随机的12肽序列,为了确保文库的多样性,这些序列可以涵盖所有可能的氨基酸组合。之后进行多肽的合成,目前采用较多的方法是固相合成法,为了防止发生副反应,所有参与反应的氨基酸都受到保护基团的保护,常用的保护基团有Fmoc和BOC等,首先将C端的氨基酸连接到固相载体上,并脱去其保护基团,依次加入剩余的氨基酸,并重复洗脱保护基团、连接和洗涤的步骤,直至合成完整的12肽序列。生成的12肽序列被融合到M13噬菌体pIII蛋白的N端,进而通过噬菌体展示技术去进行筛选与鉴定。
Fig. 1 多肽文库合成原理图
固相筛选和液相筛选是两种常用的随机肽库筛选方法,其中,固相筛选会将靶标分子固定在固相载体,如96孔板上,然后将多肽文库与固定的靶标分子孵育,之后通过洗涤去除未结合的多肽,最后将结合的多肽从固相载体上洗脱下来进行后续分析。固相筛选的操作相对简单,无需对抗原进行标记,可以同时处理多个样品,适用于大规模筛选,但也容易发生非特异性结合。液相筛选主要采用磁珠等作为筛选平台,将靶抗原与磁珠结合后,与多肽文库进行孵育,之后将与多肽结合的磁珠分离出来,进行后续的分析和鉴定。液相筛选可以减少非特异性结合的发生,但需要特殊的仪器设备才能操作,适用于抗原浓度梯度降低的筛选以及高亲和力多肽的筛选。
泰克生物致力于为客户提供高质量的多肽文库构建技术服务,我们在多肽文库构建方面拥有丰富的项目经验和心得,经过多年的发展,泰克生物建立了完善的多肽文库构建体系,包括依赖M13辅助噬菌体的M13噬菌体展示体系、M13KE噬菌体展示体系、T7噬菌体展示体系等,能够为客户提供高质量的线性多肽文库(包括但不限于6肽库、7肽库、12肽库、15肽库)和环多肽文库(环6肽库、环7肽库、环10肽库等)等各种类型的多肽文库构建服务。泰克生物建立的M13噬菌体多肽文库库容可达10^8,滴度可达10^13个噬菌体展示多肽颗粒/ml,T7噬菌体多肽文库库容可达10^8,滴度可达10^11个噬菌体展示多肽颗粒/ml,足够支撑客户后续筛选到针对各类靶点且满足下游实验需求的靶向肽。泰克生物可提供包括从多肽基因库设计与合成、多肽文库构建到配套的多肽文库筛选、亲和力验证、体外细胞验证等一站式技术服务,客户只需要提供具体的项目需求,泰克生物的科学家会针对客户的项目需求设计最佳的文库构建方式和噬菌体体系,满足客户的项目需求。
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