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噬菌体展示肽库构建技术介绍

多肽因具有易制备、便于改造、免疫原性低等优点,在药物筛选和治疗上的重要性越来越受到研究者的重视。多肽根据肽键的结构分为直链肽和环肽,其中直链肽的研究最为广泛和深人,常用的噬菌体随机肽库中插人的基因经噬菌体表达后往往也是以线性直链肽的形式展示在噬菌体表面,但直链肽进人体内后容易在各类酶的作用下发生快速降解,而经过调整后的环肽在二硫键或其他结合键的作用下会形成固定构象,不但代谢稳定性和生物利用度会极大提高,而且更符合受体-配体(抗体-抗原)构象的结合要求。

 

一.肽库分类

 

已构建好的噬菌体肽库有许多种:根据表达系统不同,分为噬菌体衍生载体表达肽库和噬粒载体表达肽库;根据多肽与外壳蛋白融合的位置,分为gpI噬菌体肽库、gpV循噬菌体肽库等;根据多肽的长度,分为6肽库、8肽库、15肽库等;根据多肽的价数不同,分为单价呈现的噬菌体肽库和多价呈现的噬菌体肽库;根据多肽的空间构象,分为线型噬菌体肽库和构象型噬菌体肽库;根据肽库中所含多肽序列多样性的大小,分为部分随机肽库和随机肽库。

目前的研究以随机七肽、十二肽和环七肽库的应用最为广泛。随机线性七肽、十二肽肽库结构简单,适合模拟表位的筛选。随机环七肽库,具有环形结构可用于结合域筛选。

 

二.多肽文库的构建方法

 

生物淘金法:将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体筛选的目标蛋白可以直接吸附于酶标板,也可固定在生物小磁珠上,或者把经生物素化靶分子固定在包被在链霉亲和素的ELISA小孔或生物磁珠上(利用链霉亲和素与生物素的高亲和力)。

选择感染性噬菌体(SIP):用特定的多肽或蛋白替代P蛋白使噬菌体丧失感染力,再通过这些多肽或蛋白与其配基的结合恢复感染能力。此方法将蛋白质配基间的相互作用与噬菌体的感染扩增直接联系起来,能使特异性筛选和噬菌体扩增同时进行。

延迟感染性筛选:利用细菌表面展示系统中细菌外膜蛋白A的多用性特点,将目标蛋白的编码序列融合到杂交的外膜蛋白A来展示。当噬菌体被捕获或淘洗后,细菌被转入37℃培养,噬菌体因F纤毛得到表达而重新具有感染能力,成为被选克隆。该方法与常规筛选过程相反,即被选择的细菌才可被捕获的噬菌体感染,所以又称“反向筛选”。

 

三.多肽文库的构建流程(以M13噬菌体随机肽库为例)

 

1. M13随机肽库构建及库容检验

 

10μL连接产物电转化100μL预冷的电传化感受菌,转化后的细菌加2mL SOC培养液,37°C培养1h取1μL进行梯度稀释后,涂布含有50 μg/mL氨苄青霉素的平板,检查随机肽库的库容。其余SOC培养物加人100mL含有50μg/mL氨苄青霉素和10μg/mL四环素的SB培养液。37°C培养2h后,加人10^12噬斑形成单位(pfu)的辅助噬菌体VSC M13。继续培养2 h。5000 rpm离心15 min。弃上清后,再次加人100 ml含有50 μg/mL氨苄青霉素和10 μg/mL四环素的SB培养液。37°C培养过夜。次日5000 rpm离心15min收集上清。加人PEG8000至4%。NaCl至3%,冰浴30 min后,9000 rρm离心弃上清。用2ml含1% BSA的PBS溶液重溶沉淀,10000 rpm离心5 min,弃去不溶物、收集上清即为丝状噬菌体随机肽库。

 

2. M13噬菌体随机肽库的随机性检验

 

1μL M13噬菌体随机肽库按一定比例稀释至滴度约为100个噬斑形成单位(pfu),取五份稀释液分别加人100μL OD=1.0的F' XL1-blue菌液,室温放置15 min,铺于5块氨苄青霉素培养板,37°C培养过夜。次日计算噬斑形成单位(pfu),并在每一块氨苄青霉素培养板上挑取一个分离良好的菌斑扩增培养,抽提单链模板测定外源序列,分析肽库的随机性。

 

四.噬菌体肽库技术的应用

 

1.基因治疗:与现阶段所用的基因治疗载体相比,噬菌体有明显的优点:制备简单、廉价;对哺乳动物细胞没有噬性;遗传改造和构建比较简单。

2.抗原表位研究:抗原表位是抗原与抗体相结合的活性中心,对特定抗原活性中心的研究有利于揭示抗原与抗体相互作用的机制。对于空间构象性的抗原决定簇,可以用相应的抗体从肽库中分离出模拟抗原表位。

3.确定核酸结合蛋白:对特定的DNA或RNA来说,构建DNA或RNA结合域随机文库来进行筛选可以确定其特异性结合蛋白。

4.基因疫苗研究:从表位文库中筛选到与抗体结合、免疫原性较强的模拟表位,再将模拟肽或噬菌体肽免疫小鼠并检测小鼠并检测小鼠产生的抗体水平,确定筛选的噬菌体多肽作为疫苗的前景。

5.药物设计和药物开发:以受体或细胞因子的全序列或胞外某区段为靶分子,从肽库中筛选到具有活性(激活或拮抗)的噬菌体肽,经测序后,合成活性多肽,这些小肽序列可作为小分子多肽药物设计的依据。

 

泰克生物提供的噬菌体展示平台是一种超高通量的配体筛选方式,通过该技术平台可以构建多达10^13/mL个经过噬菌体展示的多肽或抗体克隆,平均可以做到独立克隆数为10^9-10^10/mL,经过后续多轮淘筛可以提供多达10^5有效多肽或抗体的序列,为后续酶底物,蛋白配体和高特异性抗体搜寻提供坚实的研究基础。同时,配合泰克生物的亲和力筛选平台,可以在短时间内(2-3天)获得不同的多肽或抗体与靶点蛋白目标的亲和力排序。基于噬菌体平台,泰克生物可以为客户构建随机7肽文库,12肽文库,15肽文库等,能够充分满足客户的不同需求。


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