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噬菌体抗体文库展示技术介绍

一.噬菌体抗体库技术简介

 

噬菌体抗体库技术(phage display antibody li- -brary techniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechain reaction, PCR) 扩增抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术,把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。

 

二.噬菌体抗体库技术基本原理

 

噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白III(PIII)或外壳蛋白VII (PVIlI)基因随机重组,继而感染大肠杆菌,经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv—外壳蛋白融合蛋白的形式表达。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原,又能感染宿主菌进行再扩增,经过“吸附—洗脱—扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。所构建的抗体库称为全套抗体库,从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。它的最大特点是实现了直接将基因型和表型联系在一起,可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性抗体。

 

三.噬菌体抗体库的构建

 

首先提取细胞的总RNA,经过RT-PCR扩增可变区基因,运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链PCR产物和表达载体进行酶切,再对切割产物进行分离纯化,按一定比例将载体和轻链连接,转化感受态细胞并扩大培养,提取质粒即为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切,纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞并扩大培养,提取质粒既为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切,纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞,加入辅助噬菌体培养,离心取上清,加入聚乙二醇(PEG)沉淀并收集噬菌体颗粒,这样就得到噬菌体总抗体库。

 

四.噬菌体抗体库的表达载体

 

噬菌体抗体库的表达载体可分为λ噬菌体(phageλ)、单链丝状噬菌体(filamentous phage)及噬菌粒(phagemid)三种系统,这三种系统各有其利弊。入噬菌体表达系统可通过菌斑印迹(plaquelift)筛选克隆,但外源性片段不能太大,其库容量较小(10^6)。丝状噬菌体主要为泰克生物实验室所采用,在此载体中又包括单价及多价两个子系统,可筛选出高亲和力抗体。噬菌粒是应用最多的表达载体,也是简便高效模拟B细胞产生抗体的原核表达系统。建抗体库的目的是筛选出各种特异性的抗体分子,噬菌体抗体库在这方面有无可比拟的优势。

 

五.噬菌体抗体库的筛选

 

经典的筛选方法有两种:一是将纯抗体包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体;二是将抗体与生物素基团相连,再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。在筛选过程中,噬菌体种类、固相介质表面的抗原密度或溶液中抗原的浓度,和洗涤时间三种因素对筛选的效率影响较大。同时,每一轮筛选都需要进行检测,以证实筛选的有效性。

 

六.噬菌体抗体库的优点

 

1. 方法简单易行,节省时间,可通过发酵生产来大量制备;

2.筛选容量增大,可在数周内筛选100万~1亿个克隆,可获得高亲和力的人源化抗体;

3.直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因,因此可以获得完全人源化的抗体,克服了杂交瘤细胞不稳定的缺点,避开了人工免疫和杂交瘤技术;

4.模拟体内免疫过程和天然全套抗体库,随意“制造和克隆针对任何抗原的抗体。

 

泰克生物拥有M13,T4和T7噬菌体展示体系,根据客户的项目需求,会采用不同的噬菌体进行蛋白、抗体以及cDNA的展示。在已完成的案例中,基于M13噬菌体pIII基因展示体系较为常用,构建的库容量可以达到10^11,其中有效库容量为10^9


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