酵母文库构建（SMART技术）-泰克生物-酵母展示服务专家

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酵母文库构建（SMART技术）

泰克生物凭借多年来从事技术服务，在药物抗体发现领域，积累了深厚的经验，尤其在抗体开发方面成果颇多，泰克专注于为客户提供既优质又经济高效的抗体药物早期发现解决方案，这些方案不仅满足客户的初步需求，涵盖了跨膜蛋白、离子通道、小分子化合物、多肽及mRNA等多种靶点的抗体开发服务，还进一步拓展至CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体偶联药物（ADC）研发、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体及高效阻断型中和抗体开发等后续研发环节，提供全方位支持。此外，泰克生物的动物免疫基地，能够为客户提供包括鼠、兔、羊、鸡、羊驼等多种动物源性的抗体发现服务。

噬菌体展示技术和酵母展示技术是抗体发现的两大核心支点。酵母展示技术将抗体的可变区与凝集素Aga2p进行融合表达，再利用流式细胞术，筛选出针对特定抗原的抗体。泰克生物在酵母杂交技术上的心得与经验也颇多，基于完善的酵母杂交技术，能够进行各类酵母 cDNA 文库构建（包括但不限于动物组织、植物组织、细胞等各类种属样本的核系统酵母文库构建，膜系统酵母文库构建）、随机多肽文库构建、靶向蛋白/小分子多肽的筛选等各类酵母杂交技术服务。通过该技术进行酵母 cDNA 文库构建，容量可达10^6-10^7，其多样性、插入率和阳性率均保持在90%以上，满足各类客户对于核系统酵母文库构建，膜系统酵母文库构建的质量要求。并且对于一些微量的抗体表达，酵母展示文库往往表达出的活性更为优越。

抗体发现服务的下游验证流程，例如亲和力验证、抗体阻断效果评估、交叉反应测试等，泰克生物也可以提供，并且提供抗体人源化、亲和力提升、CAR-T/CAR-NK先导序列设计以及细胞杀伤活性验证等全方位一站式技术服务。

█ 酵母文库构建（SMART技术）

SMART技术被广泛应用于酵母 cDNA 文库构建，包括核系统酵母文库构建和膜系统酵母文库构建。其原理是利用反转录酶的模板切换活性，将特异性的序列加到cDNA的5’端，从而提高全长克隆的效率。该技术的优势在于对起始RNA的需求量较小，适用于低丰度表达基因的文库构建，能够有效富集低丰度表达基因，避免冗余。利用SMART技术合成cDNA，并在其两端连接特定的接头序列，对cDNA进行均一化处理，以减少高丰度基因的冗余，并增加低丰度基因的代表性。均一化后的cDNA重组能够被到酵母载体上，如pGADT7（用于核系统酵母文库构建）或pPR3-N（用于膜系统酵母文库构建）。泰克生物基于SMART技术的酵母 cDNA 文库构建服务流程如图1所示。

酵母 cDNA 文库构建服务-泰克生物.png

图1 基于SMART技术的酵母 cDNA 文库构建服务

█ 服务内容和周期

步骤	服务内容	周期
Step1：动物免疫	(1) 动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针； (2) 免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价； (3) 若第4针血清抗体效价满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫； (4) 效价合格，采血分离单核细胞；	10周
Step2:：cDNA制备	(1) PBMC总RNA提取（RNA提取试剂盒） (2) 高保真RT-PCR制备cDNA（反转录试剂盒）	1个工作日
Step3：酵母文库的构建	基于SMART技术： (1) 酵母展示载体构建与转化：载体构建（cDNA连接酵母双杂交载体：融合AD）+电击转化酵母菌株 (2) 鉴定：随机挑选48个克隆，PCR鉴定阳性率； (3) 测序计算插入正确率和文库多样性	4-6周
Step3：酵母文库筛选	(1) 自激活验证； (2) 诱饵质粒与文库质粒共转酵母菌株； (3) 酵母筛选； (4) 筛选结果测序+回转验证；	7-9周

█ 服务优势


多种靶点抗体发现服务可选	技术平台成熟	多种动物源免疫可供选择	完整的实验记录	定制化的方案
蛋白、多肽、小分子、病毒、膜蛋白、mRNA等（可针对具体的项目需求设计定制化的多种类型抗原搭配的免疫方案）	高库容可达和高插入率，抗体亲和力较高	包括但不限于鼠、兔、羊、骆驼等	QC质控标准（免疫效价、PBMC质控、文库质控及筛选验证质控），中英文实验报告，原始实验记录	免疫方案、建库方案、筛选方案以及后续的体外表达验证方案等

酵母文库构建（SMART技术）常见问题解答

什么是酵母文库的构建？其中SMART技术是什么意思？

答：二十年来，酵母展示方法已成为发现、提高稳定性和亲和力成熟的各种蛋白质支架的常用工具，用于抗原识别。酵母展示特别适用于异二聚体蛋白的选择，例如抗体和T细胞受体（TCR），因为它允许通过间隙修复驱动的同源重组快速创建文库，并在相反交配类型的酵母交配后随后构建组合文库。酵母文库是由许多不同的基因克隆构成，这些基因克隆插入到载体中后，能够在酵母细胞内复制和表达。SMART扩增技术从生物体中提取总 RNA，并采用 RNA 模板 5' 端的转换机制（SMART）技术进行 cDNA 合成。随后，通过长距离 PCR 扩增双链 cDNA，在酵母菌株中纯化并与载体共转化。对构建的文库的质量参数进行评估，以验证构建的文库。
SMART技术的优点有什么？一般的应用是什么？

答：SMART技术即使客户的初始样本RNA的量很少的情况下，我们也可以高质量、高效的完成样本全长cDNA的扩增，这项技术比较适合低丰度表达基因进行克隆。通过一些技术手段的均一化处理后，我们能够发现SMART技术显著降低了基因的冗余度，帮助我们对那些表达量较低的基因进行了有效的富集，这样可以更好的提高我们构建的酵母文库中的基因多样性。SMART技术的操作流程更加简单，操作也更加快捷，有利于科研人员在实验室中快速开展实验。SMART技术利用反转录酶的模板切换活性，在cDNA的5'端加上特异性的序列，这样可以提高全长克隆的效率。泰克生物有严格的质控流程，通过质控流程，泰克生物使用SMART技术构建的酵母文库在库容量、平均插入片段长度以及克隆阳性率等方面均能达到较高的标准，泰克生物的科研人员能够构建出高质量、高可靠性的酵母文库，为客户不同生命科学领域的深入研究提供有力支持。
酵母文库构建服务中，SMART技术对RNA起始量的要求如何？

答：SMART技术之所以在分子生物学领域一直使用，其显著优势之一就是因为它对RNA起始量包容性强。在实验中，这项技术仅仅只需要极低的RNA起始量，通常仅需几微克（μg）的高质量RNA，便能启动并顺利完成复杂的文库构建流程。这一特点对于那些比较珍贵的样本，RNA样品难以获得的项目至关重要，比如说我们常见的稀有细胞类型分析、低丰度基因表达研究或者医院的临床样本资源有限的情况。如果遇到上述情况，SMART技术就能够大大的降低实验的门槛，不会让我们的实验被样本量所限制。尽管SMART技术要求的样本量很低，但是我们还是要注意RNA样本的质量如何，它的质量对于最终构建好的文库的多样性影响重大。因此，在使用SMART技术的情况下，也必须采用严格的RNA提取和纯化方法。
SMART技术构建酵母文库的效率如何？如何保证SMART技术构建的酵母文库的多样性？我们如何解决上述问题

答：SMART技术通过其独特的扩增机制，在RNA的5'端引入反转录酶的切换反应。然而，与某些其他的文库构建技术Gateway重组技术相比，SMART技术在某些方面的构建效率可能不如其他技术。面对这一技术方面的缺点，泰克生物的科研人员进行了积极的探索并优化了实验条件，实验方案的优化包括但不限于调整RNA提取过程中的所需溶剂的比例和提取中的温度控制、控制实验中的反应时间、循环数以及优化反应体系中的pH值等。当我们面对文库多样性不够这个问题，我们发现保证文库多样性的关键在于起始RNA样本的多样性和完整性。在提取的过程中，确保其完整性至关重要，因此，我们必须防止其降解与受到污染。至于文库构建阶段，控制过程中的偏差同样不可忽视，旨在降低特定序列的过度现象，从而有效提升酵母文库的多样性。
在酵母文库构建服务中，我们如何评估SMART技术构建的酵母文库的质量？SMART技术构建的酵母文库要是出现假阳性？我们如何解决

答：在酵母文库构建服务中，SMART技术构建的酵母文库的质量如何直接关系到后续研究的有效性和准确性。首先是文库容量，它可以直接反映了文库中包含的遗传多样性程度，高容量文库能够提供更广泛的基因资源供筛选和研究。接着是插入片段大小，插入的片段关乎文库中的基因片段。同时，一个文库中有多少个阳性克隆也可以评估质量。阳性克隆可以展示出了正确插入目标基因片段的克隆的多少，高的阳性克隆表明高的筛选和成功率。同时，假阳性问题也常常出现在文库构建中，并且不局限于SMART技术。面对假阳性的情况，我们为了减少假阳性，严格把控各种实验条件、对结果进行多重验证和生物信息学分析等。

什么是酵母文库的构建？其中SMART技术是什么意思？

答：二十年来，酵母展示方法已成为发现、提高稳定性和亲和力成熟的各种蛋白质支架的常用工具，用于抗原识别。酵母展示特别适用于异二聚体蛋白的选择，例如抗体和T细胞受体（TCR），因为它允许通过间隙修复驱动的同源重组快速创建文库，并在相反交配类型的酵母交配后随后构建组合文库。酵母文库是由许多不同的基因克隆构成，这些基因克隆插入到载体中后，能够在酵母细胞内复制和表达。SMART扩增技术从生物体中提取总 RNA，并采用 RNA 模板 5' 端的转换机制（SMART）技术进行 cDNA 合成。随后，通过长距离 PCR 扩增双链 cDNA，在酵母菌株中纯化并与载体共转化。对构建的文库的质量参数进行评估，以验证构建的文库。
SMART技术的优点有什么？一般的应用是什么？

答：SMART技术即使客户的初始样本RNA的量很少的情况下，我们也可以高质量、高效的完成样本全长cDNA的扩增，这项技术比较适合低丰度表达基因进行克隆。通过一些技术手段的均一化处理后，我们能够发现SMART技术显著降低了基因的冗余度，帮助我们对那些表达量较低的基因进行了有效的富集，这样可以更好的提高我们构建的酵母文库中的基因多样性。SMART技术的操作流程更加简单，操作也更加快捷，有利于科研人员在实验室中快速开展实验。SMART技术利用反转录酶的模板切换活性，在cDNA的5'端加上特异性的序列，这样可以提高全长克隆的效率。泰克生物有严格的质控流程，通过质控流程，泰克生物使用SMART技术构建的酵母文库在库容量、平均插入片段长度以及克隆阳性率等方面均能达到较高的标准，泰克生物的科研人员能够构建出高质量、高可靠性的酵母文库，为客户不同生命科学领域的深入研究提供有力支持。
酵母文库构建服务中，SMART技术对RNA起始量的要求如何？

答：SMART技术之所以在分子生物学领域一直使用，其显著优势之一就是因为它对RNA起始量包容性强。在实验中，这项技术仅仅只需要极低的RNA起始量，通常仅需几微克（μg）的高质量RNA，便能启动并顺利完成复杂的文库构建流程。这一特点对于那些比较珍贵的样本，RNA样品难以获得的项目至关重要，比如说我们常见的稀有细胞类型分析、低丰度基因表达研究或者医院的临床样本资源有限的情况。如果遇到上述情况，SMART技术就能够大大的降低实验的门槛，不会让我们的实验被样本量所限制。尽管SMART技术要求的样本量很低，但是我们还是要注意RNA样本的质量如何，它的质量对于最终构建好的文库的多样性影响重大。因此，在使用SMART技术的情况下，也必须采用严格的RNA提取和纯化方法。
SMART技术构建酵母文库的效率如何？如何保证SMART技术构建的酵母文库的多样性？我们如何解决上述问题

答：SMART技术通过其独特的扩增机制，在RNA的5'端引入反转录酶的切换反应。然而，与某些其他的文库构建技术Gateway重组技术相比，SMART技术在某些方面的构建效率可能不如其他技术。面对这一技术方面的缺点，泰克生物的科研人员进行了积极的探索并优化了实验条件，实验方案的优化包括但不限于调整RNA提取过程中的所需溶剂的比例和提取中的温度控制、控制实验中的反应时间、循环数以及优化反应体系中的pH值等。当我们面对文库多样性不够这个问题，我们发现保证文库多样性的关键在于起始RNA样本的多样性和完整性。在提取的过程中，确保其完整性至关重要，因此，我们必须防止其降解与受到污染。至于文库构建阶段，控制过程中的偏差同样不可忽视，旨在降低特定序列的过度现象，从而有效提升酵母文库的多样性。
在酵母文库构建服务中，我们如何评估SMART技术构建的酵母文库的质量？SMART技术构建的酵母文库要是出现假阳性？我们如何解决

答：在酵母文库构建服务中，SMART技术构建的酵母文库的质量如何直接关系到后续研究的有效性和准确性。首先是文库容量，它可以直接反映了文库中包含的遗传多样性程度，高容量文库能够提供更广泛的基因资源供筛选和研究。接着是插入片段大小，插入的片段关乎文库中的基因片段。同时，一个文库中有多少个阳性克隆也可以评估质量。阳性克隆可以展示出了正确插入目标基因片段的克隆的多少，高的阳性克隆表明高的筛选和成功率。同时，假阳性问题也常常出现在文库构建中，并且不局限于SMART技术。面对假阳性的情况，我们为了减少假阳性，严格把控各种实验条件、对结果进行多重验证和生物信息学分析等。

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